一种用于核酸高灵敏检测的液滴式数字聚合酶链式反应芯片

为了实现对核酸的高灵敏度检测,构建了一种新型的液滴式数字聚合酶链式反应(dd PCR)芯片.该芯片由产生液滴的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块和储存液滴的玻璃腔室构成.实验结果表明,该芯片可以在25 min内产生2×106个直径为20μm的微液滴(体积4.187 p L).利用该芯片定量检测了表皮生长因子受体(EGFR)基因第19号外显子,在DNA浓度为106~101copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9998);在浓度为106copies/μL的19号外显子野生型DNA中检测105~100copies/μL的突变型DNA,其检测敏感度可达到0.0001%.该方法在同一芯片上实现了液滴产生、核酸扩增和荧光信号读取的功能,在核酸绝对定量及痕量突变基因的检测中具有潜在应用前景.     

数字PCR技术进展

数字PCR是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术。与传统定量PCR技术不同的是数字PCR不依赖于扩增曲线的循环阈值(C_T)进行定量,不受扩增效率的影响,也不必采用看家基因和标准曲线,具有很好的准确度和重现性, 可以实现绝对定量分析。迄今为止,已有Fluidigm、Bio-Rad等几家公司相继推出了数字PCR产品,这些产品已经在单细胞分析、癌症早期诊断和产前诊断等研究领域显示出巨大的技术优势和应用前景。本文在现有文献基础上,对数字PCR技术的基本原理和定量方法进行介绍,并对该技术的分类及其特点以及目前的主要应用领域进行评述。     

基于微流控芯片的核酸提取技术研究进展

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的大肆传播对世界各国公共卫生防护能力与医学检测能力发起了严峻的挑战.快速、准确、灵敏的核酸扩增检测成为了当前的研究热点,而如何从复杂的生物样品中提取高纯度的核酸对保证核酸分析检测的灵敏度和准确性起着至关重要的作用.然而传统的核酸提取方法耗时长且通常需要复杂的设备,利用微流控芯片的集成...     

一种用于核酸绝对定量检测的高鲁棒性液滴式数字PCR芯片

为满足液滴式数字聚合酶链式反应(PCR)技术对扩增反应过程中稳定保存液滴以及反应后高效检测的核心需求,构建了一种具有过滤气泡和增强荧光信号功能的液滴式数字聚合酶链式反应芯片.该芯片可在10 min内产生20多万个半径约为21μm的液滴.利用"玻璃天花板"的方式构建了独立于芯片主体材料的液滴收集腔,为液滴提供稳定的保存与反应环境;还构建了过滤结构,可有效过滤混入液相中的空气,提高芯片鲁棒性.同时,在液滴收集腔中引入反射层,增强荧光信号,使单个视野荧光成像时间缩短约40%,提高了检测效率.利用该芯片定量检测EGFR基因第21号外显子,检测信号与DNA浓度在10¹～10⁵copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R²=0.998).该方案在载玻片大小的芯片上实现了液滴产生、PCR扩增和荧光信号读取,并具有较高的鲁棒性与检测效率,在核酸检测等方面具有应用潜力.     

微流控芯片技术在临床检测中的应用进展

临床检测微流控芯片是微全分析系统的一个重要研究前沿。根据检测对象和检测方法的不同,本文从免疫分析、蛋白质分析、核酸分析、细胞分析和小分子分析5个方面对微流控临床检测的最新技术进行了全面地评述。引用文献45篇。     

环介导扩增与石英晶体微天平快速检测核酸

建立环介导恒温扩增(LAMP)-石英晶体微天平(QCM)原位快速检测核酸的方法。将环介导恒温核酸扩增(LAMP)技术与石英晶体微天平(QCM)技术相结合,采用巯基化试剂分子组装方法,将LAMP反应体系中的4个引物之一固定于QCM电极上,在安装所述电极的QCM检测池中配置LAMP反应体系并进行环介导恒温核酸扩增,用QCM仪器在线原位检测频率变化,判断LAMP反应是否发生,进而判断体系中是否存在目标核酸特异基因。该方法检测核酸特异性强、灵敏度高,并且操作简便,有望发展成为快速筛查检测核酸的有效手段。     

外加场分离技术与微流控技术联用在微纳尺度物质分离中的研究进展

微纳尺度物质的分离和分选在精准医学、材料科学和单细胞分析等研究中至关重要.精准、高效和快速的分离微纳尺度物质能够为癌症的早期诊断、生物样品检测和细胞筛选提供重要帮助,其中基于外加场分离技术的分离微纳尺度物质因可以对微纳尺度物质高效在线分离和分选,被广泛应用于微纳米颗粒、外泌体以及生物细胞的分离工作中,而目前多数外加场分...     

流动型微流控PCR扩增芯片的研究

组装了由注射泵进样系统、微流控芯片和三温区加热器组成的流动型PCR扩增系统,该系统具有扩增速度快、交叉污染小、芯片可重复使用和操作方便等特点.优化了芯片厚度、隔热材料和流速等影响PCR扩增的因素.在4.9min内经24个循环成功地扩增了浓度为1ng/100μL的λ-DNA(500bp).     

微流控芯片光学检测技术在细胞研究中的应用与进展

重点综述了芯片上细胞培养和实时检测的微系统研究及相应检测方法和技术近年来的进展.总结了多种光学检测方法和技术体系的优缺点及发展趋势,讨论了各种方法技术对细胞研究模型的研究适用范围,探讨各种检测方法和技术对活细胞、单细胞实时无损无标记检测和传感发展前景和研究进展.最后对整个芯片实验室框架下细胞研究及传感微系统的发展方向进行了有益的思路和方法展望.     

数字PCR技术的发展及应用

数字PCR(Digital PCR, dPCR)是继实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术,通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统PCR技术相比,数字PCR 技术不依赖于标准曲线,具有更高灵敏度、准确度及高耐受性,可实现对样品的绝对定量分析。近年来,随着微流控技术日臻成熟,基于微流控技术的数字PCR技术得到了快速的发展,在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。本文对数字PCR的原理、技术发展和应用进行了概述。     

一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片

构建了一种新型的可进行核酸单分子扩增和核酸绝对定量的数字聚合酶链式反应(数字PCR)微流控芯片. 应用多层软光刻技术, 以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料, 盖玻片作为基底制作了具有3层结构以及微阀控制功能的微流控芯片. 芯片的大小与载玻片相当, 可同时检测4个样品, 每个样品通入芯片后平均分配到640个反应小室, 每个小室的体积为6 nL. 以从肺癌细胞A549中提取的18sRNA为样品检测了该芯片的可行性. 将样品稀释数倍后通入芯片, 核酸分子随机分布在640个小室中并扩增. 核酸分子在芯片中的分布符合泊松分布原理, 当样品中待测核酸分子平均拷贝数低于0.5个/小室时, 则每个反应小室包含0个或1个分子. 经过PCR扩增后, 有模板分子的小室检测结果为阳性反应, 而无模板分子的小室为阴性反应, 最后通过计数阳性反应室的个数, 可绝对定量原始待测样品中的目标DNA分子拷贝数. 实验结果表明, 该数字 PCR芯片可实现DNA单分子反应和核酸绝对定量, 具有成本低、 灵敏度高、 节省时间和试剂以及操作简单等优点, 为数字PCR方法在普通实验室的应用提供了一种新途径, 可用于癌症及感染性疾病的早期诊断、 单细胞分析、 产前诊断以及各种细菌病毒的核酸检验等研究.     

滚环扩增介导的核酸信号放大策略在生物传感器中的应用研究进展

滚环扩增(RCA)是一种等温核酸扩增技术,因其具有扩增效率高、保真度高等特点,在生物传感器领域得到了广泛的应用。该文介绍了RCA技术的基本原理、RCA环状模板环化方式和RCA的扩增类型,并对基于RCA技术的荧光、比色以及电化学生物传感器进行了介绍,旨在为RCA技术在生物传感器领域的进一步发展和应用提供参考。     

One-Step Nucleic Acid Purification and Noise-Resistant Polymerase Chain Reaction by Electrokinetic Concentration for Ultralow-Abundance Nucleic Acid Detection

Nucleic acid amplification tests (NAATs)integrated on a chip hold great promise for point-of-care diagnostics. Currently, nucleic acid (NA) purification remains time-consuming and labor-intensive, and it takes extensive efforts to optimize the amplification chemistry. Using selective electrokinetic concentration, we report one-step, liquid-phase NA purification that is simpler and faster than conventional solid-phase extraction. By further re-concentrating NAs and performing polymerase chain reaction (PCR) in a microfluidic chamber, our platform suppresses non-specific amplification caused by non-optimal PCR designs. We achieved the detection of 5 copies of M. tuberculosis genomic DNA (equaling 0.3 cell) in real biofluids using both optimized and non-optimal PCR designs, which is 10- and 1000-fold fewer than those of the standard bench-top method, respectively. By simplifying the workflow and shortening the development cycle of NAATs, our platform may find use in point-of-care diagnosis.     

CRISPR/Cas技术在核酸检测中的应用进展

CRISPR/Cas是大多数细菌及古细菌基于RNA的后天免疫系统。由CRISPR/Cas系统改造而成的CRISPR/Cas技术已成为一种强大的基因编辑工具,广泛应用于基因功能研究和基因修饰与治疗。除了作为基因编辑工具,Ⅱ类Cas蛋白具有的"附属切割"特性,已被开发成一种快速、低成本且高灵敏的核酸检测工具,在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。该文总结了3种Ⅱ类Cas蛋白在核酸检测领域的代表性研究进展,并对CRISPR/Cas系统在该领域的应用前景进行了展望。     

电化学发光分析方法在核酸检测中的应用

电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)分析方法具有灵敏、快速、准确、分析适应性广等特点。本文首先介绍了ECL的基本原理和特点、ECL核酸分析方法的分类和核酸的钌标记,随后对2003年以来基于磁性微球的ECL与核酸扩增及纳米技术联用在核酸检测中的应用、直接固定的ECL核酸分析方法及毛细管电泳(CE)-ECL核酸分析方法的应用做出了评述,并对ECL核酸分析方法的发展方向进行了展望。     

One‐Step Nucleic Acid Purification and Noise‐Resistant Polymerase Chain Reaction by Electrokinetic Concentration for Ultralow‐Abundance Nucleic Acid Detection

Nucleic acid amplification tests (NAATs)integrated on a chip hold great promise for point‐of‐care diagnostics. Currently, nucleic acid (NA) purification remains time‐consuming and labor‐intensive, and it takes extensive efforts to optimize the amplification chemistry. Using selective electrokinetic concentration, we report one‐step, liquid‐phase NA purification that is simpler and faster than conventional solid‐phase extraction. By further re‐concentrating NAs and performing polymerase chain reaction (PCR) in a microfluidic chamber, our platform suppresses non‐specific amplification caused by non‐optimal PCR designs. We achieved the detection of 5 copies of M. tuberculosis genomic DNA (equaling 0.3 cell) in real biofluids using both optimized and non‐optimal PCR designs, which is 10‐ and 1000‐fold fewer than those of the standard bench‐top method, respectively. By simplifying the workflow and shortening the development cycle of NAATs, our platform may find use in point‐of‐care diagnosis.