毛细管区带电泳分析阿片受体和抗独特型抗羟甲芬太尼抗体

应用毛细管区带电泳（ＣＺＥ）分析测定阿片受体、抗独特型抗羟甲芬太尼抗体等生物大分子样品。熔融石英毛细管柱为６０ｃｍ×１００μｍｉ．ｄ．（从进样到检测器长度为５０ｃｍ）,以硼砂－氢氧化钾为缓冲液。结果表明缓冲液的ｐＨ影响ＣＺＥ对阿片受体的分析,当ｐＨ为９．０时分析效果最理想,重现性良好,测得的两个主峰与同批样品进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析得到的两个条带相符。用ＣＺＥ分析抗独特型抗羟甲芬太尼抗体（ＩｇＧ）,表明用ＰｒＯｔｅｉｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和色谱分离得到部分纯化的ＩｇＧ,迁移时间不同于对照豚鼠的ＩｇＧ。     

羟甲芬太尼(Ohmefentanyl):一个新的μ阿片受体激动剂

羟甲芬太尼(F 7302,N-[1-(β-羟基-β-苯乙基)-3-甲基-4-哌啶基]-N-丙酰苯胺)是一个合成的强效镇痛剂,小鼠上的镇痛强度为吗啡的 6300倍.Na~ (100 mM)和 GTP(50 μM)可以减少羟甲芬太尼抑制~3H-naloxone特异性结合的强度,指出这个化合物呈现阿片激动剂性质.~3H-羟甲芬太尼与小鼠脑匀浆P_2部分阿片受体的结合具有饱和性、专一性和可逆性,Scatchard分析指出两个不同的结合点(K_(D1)=0.32nM,K_(D2)=3.91nM).各种阿片类药物可以较强地抑制~3H-羟甲芬太尼的特异性结合,而非阿片类药物不能抑制这种结合.比较吗啡、DSTLE和羟甲芬太尼抑制~3H-di-hydromorphine(μ)和’~3H-[D-Ala~2,D-Leu~5]enkephalin(δ)结合到小鼠脑突触浆膜阿片受体上的强度,结果表明,吗啡、DSTLE和羟甲芬太尼抑制~3H-dihydromorphine(μ)结合的强度分别为抑制~3H-[D-Ala~2,D-Leu~5]-enkephalin(δ)结合强度的79,0.11和81.5倍,从而提示羟甲芬太尼是一个强的μ激动剂。     

羟甲芬太尼对离体器官阿片受体亚型的选择性

受体结合试验已经提示羟甲芬太尼可能是μ受体激动剂。本文研究羟甲芬太尼对离体器官阿片受体的作用。羟甲芬太尼对豚鼠迴肠与小鼠输精管电刺激引起的收缩有很强的抑制作用,它们的IC_(50)分别为0.15nM与0.89nM。在豚鼠迴肠与小鼠输精管,羟甲芬太尼的抑制作用容易被纳洛酮(μ受体拮抗剂)和Mr.2266(μ受体和k受体拮抗剂)拮抗,表明该化合物选择性作用于豚鼠迴肠与小白鼠输精管μ受体。和μ激动剂(D-Ala~2,MePhe~4,Gly-ol~5)脑啡肽一样,羟甲芬太尼在大鼠输精管只呈现激动活性,没有拮抗作用。在兔输精管(含单一的k受体),羟甲芬太尼作用很弱,IC_(50)高达149nM,比豚鼠迴肠上的作用弱1000倍。这些结果进一步证明羟甲芬太尼是一个强效的选择性μ受体激动剂。     

芬太尼类化合物与阿片μ受体相互作用的分子对接与分子动力学模拟

采用分子对接和分子动力学(MD)模拟方法研究了芬太尼类化合物与阿片μ受体的相互作用机制.先用AutoDock4.0程序将芬太尼类化合物对接到同源模建的阿片μ受体结构中,再用GROMACS程序包在水溶液体系中分别对12个芬太尼激动剂和阿片μ受体蛋白复合物进行了MD模拟研究,优化对接复合物的结构,最后利用MM-PBSA方法,在APBS程序中计算芬太尼类衍生物与阿片μ受体的结合自由能,计算出的受体配合物结合常数(Ki)与其实验值吻合较好,并预测了化合物的活性排序.结果表明,复合物蛋白结构与空载受体蛋白结构有较大差异,特别是胞内区IL2、IL3和跨膜区段TM4骨架构象变化较大,不同的化合物对受体结构影响也有差异,活性较好的化合物会增加蛋白特定区域结构的柔性.芬太尼类化合物可能是通过和受体结合后诱导阿片μ受体构象转变为活性构象,引起一系列的信号传导激活G蛋白,从而引发生理效应.     

水果及环境水样中苯醚甲环唑的高灵敏免疫分析方法研究

采用辣根过氧化物酶(HRP)催化氧化四甲基联苯胺(TMB)显色为信号输出系统,结合间接竞争反应模式建立了水果及环境水样中苯醚甲环唑的间接竞争酶联免疫分析方法(ic ELISA)。基于高特异性单克隆抗体,通过逐步优化策略,确定最佳免疫分析条件为：包被原与抗体质量浓度组合为62.5 ng/mL和0.318μg/mL,一抗竞争反应缓冲溶液为含0.05%Tween-20的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBST,pH 7.4),一抗竞争反应时间为20 min,酶标二抗稀释液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4),酶标二抗反应时间为30 min。在该条件下,苯醚甲环唑的线性检测范围(IC₂₀～IC₈₀)为0.49～3.90 ng/mL,半数抑制浓度(IC₅₀)为1.38 ng/mL,检出限(LOD)为0.33 ng/mL。在柑橘、葡萄、香蕉、草莓田水、湖水和河水样品中的平均加标回收率为72.3%～132%,相对标准偏差(RSD)不大于13%,对10种结构和功能类似物的交叉反应率(CR)均小于0.2%。该方法准...     

亚甲蓝光度法测定羟自由基

利用亚甲蓝被氧化后褪色的机理,使用Fenton试剂与亚甲蓝作用,验证了体系中起氧化作用的是羟自由基,从而建立了亚甲蓝光度法检验羟自由基的方法。试验结果表明,在过氧化氢与亚甲蓝的摩尔比为1~20范围内,亚甲蓝吸光度的降低值与Fenton试剂的加入量呈直线关系,因而可在660 nm处测定亚甲蓝的褪色程度(ΔA)对羟自由基作间接光度测定。试验同时对超声法产生的羟自由基进行了测定,表明羟自由基的生成量与超声时间成正比。     

抗EGF受体的单克隆抗体对人鼻咽癌及其他肿瘤细胞生长的影响

本文报道三种抗EGF受体的单克隆抗体(MoAbs)用于裸鼠移植入肿瘤细胞的生长抑制研究。注射MoAbs 3和176分别抑制了低分化鼻咽癌细胞系CNE-2和上皮样癌细胞系A431的生长,而相同的抗体用于宫颈癌细胞系HeLa时,则无抑制作用.用~(125)I-EGF结合试验测定了CNE-2和A431细胞膜EGF受体的含量分别为1.3×10~5/细胞(Kd 7.7×10~(-8)mol/L),1.4×10~6/细胞(Kd 2.4×10(-9)mol/L)。实验结果亦显示MoAbs 3和176分别可竞争性地抑制EGF与其受体的结合,这两种抗体同时显示良好的抑瘤效应,而不能抑制EGF与其受体结合的MoAb101,则抑瘤效果亦差。上述MoAbs在体外有补体存在时不具备杀伤CNE-2及A431等肿瘤细胞。     

胶体金免疫层析法对组织样品中磺胺甲嗯唑残留的快速检测

研究了用于快速检测组织样品中磺胺甲嗯唑残留的胶体金免疫层析检测试剂。采用免疫竞争法,将抗磺胺甲嗯唑多克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上,同时将人工合成的磺胺甲嗯唑抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线（T线）,将抗磺胺甲嗯唑多克隆抗体的羊抗兔二抗包被在硝酸纤维素薄膜表面作为质控线（C线）。T线的人工抗原与待测样品中的磺胺甲嗯唑竞争结合胶体金标记的磺胺甲嗯唑多克隆抗体,通过T线与C线的显色对比读出结果。采用该检测试剂检测组织试样时,定量下限可达20μg／L,整个检测过程只需3—5min,且与磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、盐酸克伦特罗、四环素、青霉素、链霉素无交叉反应。检测试剂具有较高的灵敏度及特异性,操作便捷,稳定可靠,可作为组织中磺胺甲嗯唑残留现场监控的有效筛检手段。     

胶体金免疫层析法对组织样品中磺胺甲噁唑残留的快速检测

研究了用于快速检测组织样品中磺胺甲噁唑残留的胶体金免疫层析检测试剂.采用免疫竞争法,将抗磺胺甲噁唑多克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上,同时将人工合成的磺胺甲噁唑抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线(T线),将抗磺胺甲噁唑多克隆抗体的羊抗兔二抗包被在硝酸纤维素薄膜表面作为质控线(C线).T线的人工抗原与待测样品中的磺胺甲噁唑竞争结合胶体金标记的磺胺甲噁唑多克隆抗体,通过T线与C线的显色对比读出结果.采用该检测试剂检测组织试样时,定量下限可达20 μg/L,整个检测过程只需3 ～5 min,且与磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、盐酸克伦特罗、四环素、青霉素、链霉素无交叉反应.检测试剂具有较高的灵敏度及特异性,操作便捷,稳定可靠,可作为组织中磺胺甲噁唑残留现场监控的有效筛检手段.     

磺胺间甲嘧啶单克隆抗体的制备

研究了磺胺间甲嘧啶单克隆抗体的制备。结果表明,得到三株单抗,其中3F7株抗体效价最高,细胞培养上清为1∶5.2×102,腹水为1∶5.5×105。通过交叉反应试验可知,单抗具有较好的特异性。     

吡虫啉单克隆抗体的制备及其间接竞争化学发光酶联免疫分析方法的建立

以吡虫啉原药和3-巯基丙酸为原料,合成了吡虫啉半抗原,通过活泼酯法将其与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）偶联制备得到完全抗原,经免疫Balb/c雌性小鼠并与骨髓瘤细胞融合获得吡虫啉单克隆抗体,建立了用于吡虫啉检测的间接竞争化学发光酶联免疫分析方法（ic-CLEIA）。优化了方法的包被原稀释倍数、抗体稀释倍数、缓冲液种类、缓冲液的pH值、一抗竞争反应时间、酶标二抗稀释倍数等条件,最适条件为：包被原质量浓度62.50 ng/mL（稀释16 000倍）,抗体质量浓度103.12 ng/mL（稀释64 000倍）,缓冲液PBS（pH 7.4）,抗原与抗体竞争反应时间30 min,酶标二抗稀释倍数1∶7 000。结果表明,在最适条件下该方法的检出限（IC10）为0.03 ng/mL,IC50为0.57 ng/mL,线性检测范围（IC20 ~ IC80）为0.083 ~ 3.99 ng/mL。与氯噻啉的交叉反应率为2.2%,与噻虫胺、呋虫胺、啶虫脒、噻虫啉、噻虫嗪5种吡虫啉结构类似物无明显交叉反应。对黄瓜和苹果样品的加标回收率为82.0% ~ 112%,相对标准偏差小于15%。实际样品检测结果与HPLC仪器方法相关性良好（r2 = 0.989）。结果表明,所建立的ic-CLEIA方法具有特异性强、灵敏度高的特点,可用于食品中吡虫啉残留的快速检测。     

特异性吗啡抗原和单克隆抗体的制备

吗啡分子的不同部位与蛋白偶联诱导出的抗体的专一性差异很大。为减少交叉反应,提高抗体分子对游离吗啡的特异性识别,选择吗啡分子N位进行修饰,合成了半抗原降吗啡,并设计和合成不同的连接臂,将半抗原用不同的连接臂与不同的载体蛋白共价结合分别制备了免疫抗原和筛选抗原,经细胞融合和筛选,成功地获得了5株可分汔抗吗啡单克隆抗体的细胞株：28H10,29D5,36G3,42D5,43C4。     

滴滴涕单克隆抗体的制备及其评价

以滴滴涕(DDT)的特征部分为基础设计并合成了半抗原4-{4-[2,2,2-三氯-1-(4-氯-苯基)-乙基]-苯基}-丁酸(DDT-H1)、4-[4-(2,2,2-三氯-1-对甲苯基-乙基)-苯基]-丁酸(DDT-H2),并采用活泼酯法制备免疫原DDT-H1-BSA,以及混合酸酐法制备包被原DDT-H1-OVA、DDT-H2-OVA;用DDT-H1-BSA对小鼠进行免疫,通过细胞融合、筛选、克隆等步骤得到1株能稳定分泌DDT农药抗体的单克隆细胞株。细胞株经扩大培养后,注射小鼠体内产生腹水,并将其用辛酸-硫酸铵和protein A柱子纯化出单克隆抗体。其分泌的单克隆抗体免疫球蛋白亚类为Ig G1,单抗腹水的效价为1.68×105,亲和力Ka为5.238×1011L·mol-1,与其它几种代谢物有一定的交叉反应。在此基础上,利用获得的单抗研究建立DDT的间接竞争酶联免疫吸附检测法(ic ELISA)。结果表明,所建立的间接竞争ELISA方法的线性范围(IC20~IC80)为6.6~521.8 ng/m L,可用于检测农副产品、环境中残留的DDT及其代谢物。     

基于新亚甲蓝为介体的免疫传感器的研究

利用共价键合法,将新亚甲蓝(NMB)与辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体(Ab)修饰于玻碳电极表面,制成一种新型的电流型免疫传感器。研究了该传感器对H2O2的电化学响应及对小鼠IgG抗原(m IgG)的免疫检测。结果表明NMB作为介体能有效地传递电子,测得电子转移系数为0.77,表观反应速率常数为1.18 s-1。利用传感器对m IgG的检测,线性范围为0.5~3μg/L;检出限为0.028μg/L;相关系数r为0.996。     

波形蛋白-核酸复合物诱导的多特异性单抗

本文首次采用中间纤维波形蛋白(vimentin)-核酸复合物免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备了一组多特异性单克隆抗体(polyspecific McAb),这些抗体能够分别与波形蛋白、DNA、磷脂以及其它生物化学结构不同的生物大分子结合,其抗原特异性与病人血清中的自身抗体(autoantibody)极为相似。抗原表位分析结果表明,抗体所识别的波形蛋白NH_2末端恰是波形蛋白结合DNA的位点。多特异性单抗的研制将为研究抗体交叉反应机制、自身抗体来源以及核酸与蛋白质的相互关系提供了一条新的途径。     

硼酸根与甲阶酚醛树脂中酚羟基和邻位羟甲基的螯合反应

通过溶液pH值的测定和红外光谱分析，研究硼砂与甲阶酚醛树脂水溶液的反应表明：在水溶液中硼砂能与甲阶酚醛树脂很快地发生反应；硼砂水解产生的B／（OH)4^-，以定量的方式与树脂中酚羟基和邻位羟甲基以共价配键相结合，形成具有四面体结构的螯合物，并放出H^ 离子。     

化学发光免疫分析检测人血清中的癌胚抗原

基于辣根过氧化物酶(HRP)催化H2O2氧化3-(4-羟苯基)丙酸(PHPPA),生成能发荧光的3-(4-羟苯基)丙酸二聚体.在乙腈介质中,在增强剂眯唑参与下,与双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯(TCPO)和H2O2反应产生强化学发光.用辣根过氧化物酶(HRP)标记癌胚抗原(CEA)单克隆抗体,通过CEA的双抗夹心免疫...     

玉米根尖ABA结合蛋白的免疫金银法定位

以抗ABA结合蛋白抗体和抗(+)ABA单克隆抗体的独特型抗体,采用免疫金银法显示玉米根尖中ABA结合蛋白,获得了相互印证的结果。在分生区,标记物均匀分布于各个细胞中;在伸长区,标记物主要集中于中柱鞘和表皮细胞;从整个根尖看,随着细胞的个体发育进程,细胞内标记物呈现由均匀分散到集中、由稠密到稀少的变化趋势。细胞内的标记物主要出现于细胞核和邻近质膜区域,定位结果揭示ABA结合蛋白的分布与细胞核的存在有明显的依存性。     

基于高特异性单克隆抗体的间接竞争ELISA检测食品中胭脂红的研究

该研究设计合成了一种胭脂红半抗原,分别采用重氮化法和戊二醛法将半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原,通过免疫Bal b/c小鼠及杂交瘤技术成功筛选制备了胭脂红高特异性单克隆抗体,与苋菜红、柠檬黄等结构类似物无交叉反应.基于该抗体建立了间接竞争酶联免疫分析方法用于检测食品中胭脂红残留.该方法对胭脂红的半抑制浓度(IC50)和...     

抗拟除虫菊酯类农药广谱性单克隆抗体的研制及鉴定

制备了抗拟除虫菊酯类农药(Pyrethroids)的广谱性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性;以间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原,用活性酯法将其与牛血清蛋白(BSA)偶联制得人工抗原PBA-BSA免疫Balb/c小鼠,5次免疫后选择效价最高、对PBA识别能力最强的小鼠取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG1500作用下融合,经间接ELISA筛选及有限稀释法进行亚克隆,分离阳性细胞株,腹水诱导法大量制备单克隆抗体,并用Protein G亲和柱纯化,间接ELISA法测定抗体效价、亚型、亲和力常数及对拟除虫菊酯类农药的作用;UV结果显示,PBA-BSA成功偶联,获得1株稳定分泌抗拟除虫菊酯类农药单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11,其培养腹水抗体效价为1∶6.5×106,其抗体亚类为IgG1,对PBA的亲和力常数为2.5×10 L/mol,对PBA的IC50为208.9μg/L,检出限为21μg/L,对高效氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯和氯氰菊酯的IC50分别为1.01,2.15,3.16和3.67μg/L。