胶体金和Taq DNA聚合酶的相互作用研究

聚合酶链反应（PCR）是体外扩增DNA序列的技术，据报道：一定浓度的胶体金可以提高PCR的特异性。本文研究了胶体金与Taq DNA聚合酶(Taq)的相互作用。紫外-可见光谱，X射线光电子能谱(XPS)和光子交叉相关光谱 (PCCS)的结果表明，当胶体金和Taq溶液混合时会生成Taq-金结合物。用透射电镜(TEM)进一步研究发现，Taq-金结合物颗粒仍然呈球形，并且具有很好的分散性。通过分析PCR扩增产量，发现胶体金的加入会抑制PCR反应，而添加聚合酶的用量可以明显地消除这种抑制现象，这表明胶体金和Taq的相互作用会导致Taq的活性下降。     

豚草聚合酶链反应产物的高效毛细管电泳检测

利用PE270A－HT型高效毛细管电泳仪,采用无胶筛分电泳,以羟丙基甲基纤维素（HPMC）为筛分介质,对三裂叶豚草（Ambrosia trifida L.)的聚合酶链反应（PCR）产物进行了分离分析,显示了高效、快速、无污染的毛细管电泳技术在植物DNA片段多态性分析方面的巨大的潜力。     

聚合酶链反应产物的HPLC定量分析

建立了ＨＰＬＣ分析聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物的方法,探讨了梯度、流速、柱温等条件对相对分子质量参照物λ－ＤＮＡ－ＨｉｎｄⅢ分离的影响,ＮａＣｌ以４０～５０ｍｍｏｌ／ｍｉｎ的梯度变化,流速为１ｍＬ／ｍｉｎ时分离效果最佳。该法精密度和回收率高、线性良好,可用于ＰＣＲ扩增条件优化时的相对定量分析。     

高效液相色谱法分析逆转录聚合酶链反应产物

建立了分离逆转录聚合酶链反应（ＲＴ ＰＣＲ）产物的高效液相色谱方法,反应液直接进样,用ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ ＮＰＲ柱分离,Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲溶液（ｐＨ９０） 氯化钠线性梯度洗脱,于２６０ｎｍ处检测。用所建立的方法分析了大鼠肠缺血／再灌注损伤后外周血中性粒细胞（ＰＭＮ）磷脂酶Ａ２ｍＲＮＡ的表达。     

基于DNA聚合酶I的新型电化学传感器及其胰腺癌K-ras基因点突变检测

本文构建DNA聚合酶I的新型DNA电化学传感器,将捕获探针通过Au-S键固定于Au基底表面,与互补靶序列杂交至点突变前一个碱基,通过DNA聚合酶Ⅰ将dUTP-biotin连接在目标DNA的检测位点,再与avidin-HRP反应,而后测定在TMB溶液中的电化学特性. 结果表明,DNA电化学传感电极的检测电流值与K-ras突变型基因浓度（1.0×10^-15 ~ 1.0×10^-10 mol·L^-1）对数呈良好的线性关系,且灵敏度高,特异性较佳.     

毛细管电泳核酸分析用于重大疾病诊断的研究

对毛细管电泳核酸（包括基因和核苷）分析在重大疾病诊断中的应用作了较为详细的论述,同时概括了相关的毛细管电泳方法和聚合酶链反应,并对今后的工作作了展望。     

螺旋通道微流控PCR芯片连续自动扩增DNA片段的研究

研制了由内向外流动的螺旋通道微流控PCR玻璃芯片,减少了PCR反应液在微通道中流动时的分散和阻力;讨论了扩增循环数和进样速度对长片段基因扩增的影响,在26min内成功扩增了质量浓度仅为10ng/mL的6012bpλ-DNA;通过将小孔径石英毛细管作为顺序注射(SI)系统的连接管路,使其死体积降到0.30μL.实现了微升级样品的自动换样、连续PCR扩增和微通道洗涤等功能.样品间无交叉污染.每小时可扩增500bpλ-DNA试样7个.扩增产物片段大小和荧光强度的相对标准偏差分别为0.4%和6.7%.     

全血改进线性指数聚合酶链式反应用于焦磷酸测序检测基因多态性

焦磷酸测序是目前基因多态性检测的主要方法之一,但是其前期的样本制备工作较为繁琐,限制了其在临床检测中的应用。为了简化焦磷酸测序的流程,本研究根据不对称PCR原理,改进了线性指数聚合酶链式反应(LATE-PCR)的引物设计方法,增加过量引物的长度和浓度,并结合全血直接扩增技术,建立了基于普通r Taq聚合酶和高p H缓冲液(Hp H Buffer)的全血改进LATE-PCR(Improved LATE-PCR,im LATE-PCR)方法。考察了方法的最优扩增体系、血液抗凝剂对其影响以及全血模板量。采用单管、一步法直接扩增出单链测序模板,成功地对24例临床血样的乙醇脱氢酶基因多态性进行了检测,检测结果可用于指导临床个体化用药。24例样本的基因型分别为ADH1B位点AA纯合6例、AG杂合14例、GG纯合4例;ADH1C位点GG纯合20例、AG杂合4例、AA纯合0例。     

一种DNA染料结合聚合酶链反应检测鉴别植物病原细菌死活细胞

建立了一种将DNA染料(EMA)结合PCR的新分析方法, 用于有效检测区分植物病原细菌死活细胞. 结果表明, 当用2.0 mg/L或更高浓度的EMA渗透处理含有106 cfu/mL的死细胞菌悬液后再曝光处理10 min, 其PCR结果呈阴性, 而未经过EMA渗透处理的对应样品PCR结果呈阳性; EMA渗透处理含有适当数量病菌活细胞的种子浸泡液后, 更有助于特异性检测混合体系中靶标菌活细胞. 分析认为, 该方法避免了传统PCR无法区分细菌死活细胞的弊端, 是一种快速、灵敏且能有效鉴别病原细菌死活细胞的新方法.     

多重聚合酶链反应-毛细管电泳-激光诱导荧光法检测三种食源性致病菌

建立了食品中常见致病菌大肠杆菌O157:H7的uidA基因、沙门菌的invA基因和志贺菌的ipaH基因的多重聚合酶链反应（PCR）产物的毛细管电泳快速检测方法。根据这3种致病菌的特异性基因序列设计多重PCR引物,优化PCR扩增反应体系,采用7.0 g/L 甲基纤维素为筛分介质,毛细管电泳-激光诱导荧光检测法同时检测了3种常见致病菌的PCR扩增产物。在优化的多重PCR反应和毛细管筛分电泳条件下,该方法可以同时检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157:H7基因的多重PCR扩增产物,22 min内即可完成3种常见致病菌的毛细管电泳检测。迁移时间的相对标准偏差为1.47%~2.07%。与凝胶电泳法比较,该法简便快速,灵敏度高,可用于多种致病菌脱氧核糖核酸的检测,为食品安全提供了一种可靠的快速检测方法。     

水稻腊质基因分子特性的研究

水稻腊质基因(Wx)负责胚乳与花粉粒中直链淀粉的合成。我们通过对限制图和DNA顺序有重叠的两个基因组克隆的分析,测定出了水稻Wx基因全长为5499bp的DNA顺序。比较水稻、玉米(Klsgen等)和大麦(Rohde等)中Wx基因的DNA顺序,弄清水稻Wx基因中存在13个内含子和14个外显子,通过微机对外显子顺序的翻译,得出了水稻Wx蛋白包括转运肽在内的609个氨基酸的排列顺序,并计算出它的分子量约为72kD。经比较,水稻Wx成熟蛋白的氨基酸顺序与玉米、大麦的没有明显地差异。但是,水稻Wx基因5′-上游区、3′-下游区和内含子区域的DNA顺序,以及Wx前体蛋白的转运肽区域的氨基酸顺序与玉米和大麦Wx基因的相应区域相比,它们之间的同源性却很低。     

五引物单管聚合酶链反应(PCR)扩增法快速测定人CYP2D6*10等位基因的类型

以人CYP2D6*10等位基因位点为研究对象,建立了一种由5条引物同时PCR扩增在单管中进行等位基因快速检测的新方法。该方法在等位基因特异性扩增法的基础上,在内引物3′端引入了一个人工错配碱基并在5′端附加一段“尾巴”作为引物的锚定部分,使扩增反应的特异性得到了提高。本实验所建立的方法可在单管中同时完成SNP3种可能等位基因类型的快速检测。实测了47份样品的CYP2D6*10等位基因的类型,并随机对其中20份样品的测定结果用RFLP法进行了验证,结果完全一致。结果表明本法简便、快速,结果准确。     

透明导电玻璃(ITO)基材自加热传感静态芯片聚合酶链反应(PCR)

利用商品化ITO玻璃导电层的温阻效应, 无需任何微加工手段, 实现了自加热和传感的芯片温度自动程序控制, 最大程度地减小了传感滞后对温度控制稳定性的影响, 温度控制的稳定性达到了0.2 ℃, 升温速度最快可达20 ℃/s以上, 在冷却风扇辅助下降温速度最快达到了8 ℃/s. 芯片温控单元的引线从传统的两对(一对用于传感, 一对用于加热)减少为一对. 通过在该芯片上直接构建多个开放微池反应器的方法成功地实现了λDNA 157 bp片段的并行扩增. 将该芯片置于倒置荧光显微镜样品台上, 以蓝色(575 nm)发光二极管为光源, 以光电倍增管为检测手段检测了dsDNA和SYBR Green Ⅰ嵌合物的荧光强度随温度的实时变化曲线.     

微流控芯片电泳-多重聚合酶链反应法同时测定多个单碱基多态性位点

以微流控芯片电泳为检测平台,建立了多重PCR扩增法同时测定多个单碱基多态性(SNP)位点的方法。先通过PCR扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;用限制性内切酶消化成短片段,再将酶切反应产物与脱氧核糖核酸适配器(DNAadapter)相连;以连接产物为模板,分成两管,分别用n条等位基因特异性引物和一条通用引物进行n重PCR扩增;最后用微流控芯片电泳法分离PCR扩增产物,根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。以细胞色素P4502D6(CYP2D6)基因中的5个SNP位点(100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T)为检测对象,考察了各等位基因特异性引物之间的相互影响和扩增反应的特异性,采用微流控芯片电泳法成功测定了20名健康中国人的CYP2D6基因中5个SNP位点的基因多态性,与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)测定结果完全一致。     

蚕豆16S rRNA基因前导顺序的一级结构分析

通过测定蚕豆16S rRNA基因前导顺序的一级结构并和其它物种相应顺序的比较发现:(1)在蚕豆16S rRNA基因上游不存在F1和X蛋白基因;(2)蚕豆的F3的保守区域更接近于保守顺序;(3)蚕豆的F3的—10区3’端后更富含A-T核苷酸对;(4)油菜、烟草、玉米和菠菜的16s rRNA基因5’端上游能形成一个稳定的基环结构,而蚕豆则不能。我们由此认为蚕豆的rDNA启动子比油菜的要强,增加转录是一个担负起两个rDNA拷贝功能的原因之一。     

聚合酶链式反应微芯片系统用于微量生物样品的快速扩增检测

基于MEMS微加工技术设计和制作了一种集成微加热器和温度传感器的聚合酶链式反应（PCR）微芯片。PCR微芯片结构通过有限元模拟验证分析。该芯片在PCR扩增过程中具有良好的制热效率和热传递均匀性。在微型温度控制电路装置下进行热循环反应,芯片的温度起伏小于1℃／s,升降温速度分别达到5℃／s和3℃／s,30个热循环耗时30min。此系统已经用于GUS基因的扩增检测,获得了良好的结果,极大的缩短了热循环的时间,可用于微量生物样品的快速扩增检测。     

激光诱导荧光毛细管电泳法优化随机寡核苷酸文库聚合酶链反应扩增的条件

寡核苷酸文库的聚合酶链反应(PCR)扩增是指数富集系统配基进化技术(SELEX)筛选适配子技术中的重要步骤.本研究采用毛细管电泳技术结合激光诱导荧光检测器(CE-LIF),通过对双链产物、PCR副产物以及剩余引物的考察,研究了寡核苷酸文库PCR扩增时的影响因素,并对其进行优化.结果表明,随机寡核苷酸文库的扩增与传统均一模板的扩增显著不同,其在扩增十几个循环时产物就达到最大值;此外,初始模板数、退火温度、DNA聚合酶浓度等条件也有所不同.因此, 在进行SELEX筛选之前必须对文库PCR条件进行详细优化.本研究中N39文库优化后的PCR扩增条件为:初始模板的量为105个分子,DNA聚合酶浓度0.05 U/μL,退火温度70 ℃,18个循环.本研究为利用SELEX技术有效筛选适配子,降低筛选的假阳性及提高特异性提供了参考依据.     

发夹结构DNA探针用于检测白血病PML/RARA融合基因的电化学传感器的研究

基于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）中PML／RARA（promyelocytic leukemia／retinoic acid receptor alpha）融合基因的碱基序列,设计了一种新型发夹结构DNA电化学探针,并将此探针固定在玻碳电极表面,采用自行合成的硝基吖啶酮（NAD）作杂交指示剂,应用循环伏安法与差分脉冲伏安法实现了对人工合成的APLPML／RARA融合基因的检测,同时对检测条件进行优化。结果表明,在pH7．0Tris—HCl缓冲液中,杂交前后NAD氧化峰电流差值与靶标链浓度在2．0×10^-8～1．0×10^-7mol·L^-1范围内呈良好的线性关系,检出限为3．0×10^-9mol·L^-1。     

一种αⅠ型干扰素基因新变种的发现和鉴定

本文从一名中国汉族正常人胎肝细胞染色体DNA中,应用PCR方法两次获得长为520 bp的人α型干扰素基因,核苷酸序列测定表明,两次扩增产物的DNA序列完全相同,与过去分离克隆的IFN-αI和IFN-αD基因相比较,其第410位和第541位核苷酸分别为C和G,由此推测它编码的IFN成熟肽第114位和第158位氨基酸应为Ala和Val,其余位点则与IFN-αD和IFN-αI完全相同.我们建议将IFN—αD,IFN—αI和我们分离的IFN-αI/158V基因分别命名为IFN-αIa,IFN-αIb和IFN-alc基因.     

石墨烯修饰玻碳电极用于急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因的检测

应利用电化学还原法将固定在玻碳电极表面的氧化石墨还原为石墨烯,然后再利用偶联活化剂将氨基修饰的急性早幼粒细胞白血病（APL）PML／RARα融合基因序列探针固定到石墨烯修饰电极表面,以亚甲基蓝（MB）为电化学杂交指示剂,并由差分脉冲伏安法检测人工合成APL的PML／RARα融合基因.结果表明,石墨烯对MB的检测信号起到了很好的增敏作用,杂交前后MB还原峰电流差值与靶标链DNA浓度在5×10-10~2.5×10-9 mol/L范围内呈线性关系,检出限为8×10-11 mol/L.该方法简单、特异性好,有望用于实际样品的检测.