激光诱导荧光毛细管电泳法优化随机寡核苷酸文库聚合酶链反应扩增的条件

寡核苷酸文库的聚合酶链反应(PCR)扩增是指数富集系统配基进化技术(SELEX)筛选适配子技术中的重要步骤.本研究采用毛细管电泳技术结合激光诱导荧光检测器(CE-LIF),通过对双链产物、PCR副产物以及剩余引物的考察,研究了寡核苷酸文库PCR扩增时的影响因素,并对其进行优化.结果表明,随机寡核苷酸文库的扩增与传统均一模板的扩增显著不同,其在扩增十几个循环时产物就达到最大值;此外,初始模板数、退火温度、DNA聚合酶浓度等条件也有所不同.因此, 在进行SELEX筛选之前必须对文库PCR条件进行详细优化.本研究中N39文库优化后的PCR扩增条件为:初始模板的量为105个分子,DNA聚合酶浓度0.05 U/μL,退火温度70 ℃,18个循环.本研究为利用SELEX技术有效筛选适配子,降低筛选的假阳性及提高特异性提供了参考依据.     

定量聚合酶链式反应研究新疆小河古代样本的DNA

利用定量聚合酶链式反应来检测PCR起始阶段的古DNA模板数是鉴定古DNA保存状况以及确保其真实性的有效方法之一。采用SYBRgreenI法对距今3800年左右的新疆小河墓地出土的5例样本线粒体DNA的3个不同长度片段(138bp、209bp和363bp)及核DNA(AMG基因)进行定量。线粒体DNA定量结果显示:小河样本古DNA扩增效率与扩增序列长度成负相关性,只有138bp的结果高于每微升150拷贝。虽然大部分小河样本的AMG基因定量结果都在30拷贝以内,仍然可以进行核DNA的STR或SNP分析。本实验首次通过定量PCR的方法,证明在同一个体中的牙齿中的DNA拷贝数要高于骨骼中的。     

具有原核基因启动子活性的家蚕核多角体病毒的DNA片段

本文利用大肠杆菌启动子克隆用质粒pHE5,克隆和分离了家蚕核多角体病毒基因组的8种HindⅢ酶解DNA片段和一种SalⅠ酶解DNA片段。我们发现它们都具有指导抗四环素基因表达的启动子活性。测定了含有这些DNA片段的重组质粒的菌株抗四环素能力。其中最高的可以抗四环素至每毫升约30μg。我们分析了一个DNA片段的部分核苷酸顺序。发现它具有与原核基因启动子极相似的顺序结构。     

一种αⅠ型干扰素基因新变种的发现和鉴定

本文从一名中国汉族正常人胎肝细胞染色体DNA中,应用PCR方法两次获得长为520 bp的人α型干扰素基因,核苷酸序列测定表明,两次扩增产物的DNA序列完全相同,与过去分离克隆的IFN-αI和IFN-αD基因相比较,其第410位和第541位核苷酸分别为C和G,由此推测它编码的IFN成熟肽第114位和第158位氨基酸应为Ala和Val,其余位点则与IFN-αD和IFN-αI完全相同.我们建议将IFN—αD,IFN—αI和我们分离的IFN-αI/158V基因分别命名为IFN-αIa,IFN-αIb和IFN-alc基因.     

微流控芯片电泳-多重聚合酶链反应法同时测定多个单碱基多态性位点

以微流控芯片电泳为检测平台,建立了多重PCR扩增法同时测定多个单碱基多态性(SNP)位点的方法。先通过PCR扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;用限制性内切酶消化成短片段,再将酶切反应产物与脱氧核糖核酸适配器(DNAadapter)相连;以连接产物为模板,分成两管,分别用n条等位基因特异性引物和一条通用引物进行n重PCR扩增;最后用微流控芯片电泳法分离PCR扩增产物,根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。以细胞色素P4502D6(CYP2D6)基因中的5个SNP位点(100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T)为检测对象,考察了各等位基因特异性引物之间的相互影响和扩增反应的特异性,采用微流控芯片电泳法成功测定了20名健康中国人的CYP2D6基因中5个SNP位点的基因多态性,与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)测定结果完全一致。     

基于DNA聚合酶I的新型电化学传感器及其胰腺癌K-ras基因点突变检测

本文构建DNA聚合酶I的新型DNA电化学传感器,将捕获探针通过Au-S键固定于Au基底表面,与互补靶序列杂交至点突变前一个碱基,通过DNA聚合酶Ⅰ将dUTP-biotin连接在目标DNA的检测位点,再与avidin-HRP反应,而后测定在TMB溶液中的电化学特性. 结果表明,DNA电化学传感电极的检测电流值与K-ras突变型基因浓度（1.0×10^-15 ~ 1.0×10^-10 mol·L^-1）对数呈良好的线性关系,且灵敏度高,特异性较佳.     

重组人OCIF结构域D1～D6基因在毕赤酵母中的表达

利用PCR以实验室构建的原核重组表达质粒pProEX-OCIF为模板扩增得到N末端融合有6×His标签和rTEV蛋白酶识别序列的人破骨细胞形成抑制因子(OsteoclastogenesisInhibitoryFactor,简称OCIF)结构域D1～D6(简称O CIFm)编码基因片段;将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌TOP10,筛选得到阳性重组质粒pMD18-OCIFm,双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIFm基因片段;将其定向插入甲醇营养型酵母分泌表达载体pPIC9中,构建获得重组表达质粒pPIC9-OCIFm.测序验证后,以限制性内切酶SalⅠ线化,电穿孔转化酵母宿主菌GS115.筛选得到阳性表达菌株后,甲醇诱导表达4d,SDS-PAGE和Westernblot对表达情况进行分析和确认.所获得的OCIFm基因片段在甲醇营养型酵母中表达量占菌体总蛋白的30%以上.利用Ni-NTA树脂对表达产物进行一步亲和层析纯化.活性测定表明纯化的表达产物可诱导体外培养的成熟破骨细胞样细胞的凋亡.表达产物的生物学活性较利用原核表达系统明显提高.     

基于金纳米颗粒信号放大效应电化学检测DNA聚合酶

基于金纳米颗粒(AuNPs)比表面积大、 尺寸小和能够承载大量DNA片段的特点, 建立了一种免标记、 简便、 快速检测DNA聚合酶Klenow fragment exo-(KF^-)的电化学方法. 首先将巯基化的DNA引物片段修饰在金电极上, 然后加入模板DNA链以及修饰有报告DNA链的金纳米颗粒(AuNPs-DNA), 模板DNA链能同时与DNA引物片段和修饰在AuNPs上的报告DNA链进行互补杂交形成"三明治"结构, 从而将AuNPs-DNA修饰在电极表面; 当加入电活性物质钌铵(RuHex)后, RuHex可通过静电吸附作用结合在DNA上. AuNPs上修饰的报告DNA链能够吸附大量RuHex, 导致电化学信号放大. 当加入脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及KF^-聚合酶后, 引物片段发生延伸反应, 将与模板DNA链杂交的AuNPs-DNA竞争下来, 带走大量的RuHex, 使电信号降低, 从而实现对聚合酶的检测. 实验结果表明, 利用该方法可以检测到5 U/mL的KF^-.     

Azorhizobium caulinodans ORS571结瘤位点5(nod locus 5)的鉴定

用克隆的含A.caulinodans ORS 571 nodABC基因启动子区域(P_1)的800bp AccⅠ-pUC Ⅱ DNA做探针,在染色体上探测到另一个与P_1同源的8.4kb DNA片段,从ORS571 pLAFR1基因文库中分离到带有该片段的克隆子pRG90,8.4 kb DNA的内切酶图谱分析及DNADNA杂交实验表明同源区(P_2)位于450bp SmaⅠ-SphⅠ片段内。用Ω因子对8.4 kb DNA进行缺失插入突变,鉴定出一个使S.rostrata结瘤延迟的突变株ORS571-5。该突变株结瘤延迟的表型可由pRK84质粒(nod locus 5)互补。     

中国人ω1型干扰素基因的克隆、一级结构测定以及在大肠杆菌中的表达

采用聚合酶链反应(PCR)方法,从中国正常胎儿肝细胞染色体DNA中分离并克隆了人ω1型干扰素基因,测定了核苷酸全序列,表明原有争议的第88位密码子为GGA的核苷酸序列是正确的,因此该氨基酸为Gly。随后又利用PCR技术将所获的ω1型干扰素基因原始克隆改造成适于在大肠杆菌中表达非融合蛋白的结构形式,并以pBV220为载体在P_RP_L串联启动子控制下进行温控表达。表达产物的抗病毒活性达6.5×10~7单位/升菌液(O. D_600=0.75)。IFN-ω1不仅具有很高的抗病毒活性,同时在结构上与动物滋养层蛋白高度相似,而后者又是作为母体妊娠识别信号存在于多种动物体内的抗黄体退化蛋白,因此本文获得的这—ω1型干扰素基因及重组蛋白在理论和实际上都有进一步研究的价值。     

毛细管电泳检测肺癌基因突变的方法学研究

建立了一种毛细管电泳快速高效检测聚合酶链反应(PCR)扩增产物以及限制性内切酶酶切产物的方法,使其更好地用于基因诊断.以聚环氧乙烷(poly(ethylene oxide),PEO)为筛分介质,用涂层的毛细管柱(37 cm×75 μm,有效长度27 cm)分离pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ) Marker标准DNA片段.考察了筛分介质的质量浓度、pH值、毛细管柱的温度和运行电压.在1×TBE (pH 8.2)电泳液、电压15 kV、温度15 ℃,于10 min内成功分离了Marker标准DNA片段.该方法快速、灵敏、准确,用于临床76例肺癌患者正常组织和肿瘤组织p53基因和ras基因点突变情况的检测,结果满意.     

马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

电化学发光-聚合酶链式反应方法检测胰腺癌中K-ras基因点突变

发展了一种可用于快速检测胰腺癌中K-ras癌基因点突变的电化学发光-聚合酶链式反应(ECL-PCR)分析方法。该法采用三联吡啶钌标记的上游引物和生物素标记的下游引物对目的片段进行PCR扩增;再采用限制性内切酶MvaI对扩增产物进行酶切。由于野生型样品和突变型样品间存在酶切位点的变化,其中只有野生型样品能被切断;通过生物素与链霉亲和素包被的磁珠连接,将生物素标记的DNA片段收集到检测池中,进行电化学发光检测。采用该法对13例胰腺癌组织中的K-ras癌基因第12位密码子进行点突变分析,只需要10μL样品、20min孵育时间和30s采集时间,就可得出其中有12例存在点突变,点突变率为92.3%。本方法操作简便、安全、快速、灵敏,可用于检测任何一种导致限制性内切酶位点改变的基因点突变。     

胶体金和Taq DNA聚合酶的相互作用研究

聚合酶链反应（PCR）是体外扩增DNA序列的技术，据报道：一定浓度的胶体金可以提高PCR的特异性。本文研究了胶体金与Taq DNA聚合酶(Taq)的相互作用。紫外-可见光谱，X射线光电子能谱(XPS)和光子交叉相关光谱 (PCCS)的结果表明，当胶体金和Taq溶液混合时会生成Taq-金结合物。用透射电镜(TEM)进一步研究发现，Taq-金结合物颗粒仍然呈球形，并且具有很好的分散性。通过分析PCR扩增产量，发现胶体金的加入会抑制PCR反应，而添加聚合酶的用量可以明显地消除这种抑制现象，这表明胶体金和Taq的相互作用会导致Taq的活性下降。     

微流控振荡流反转录聚合酶链式反应快速检测烟草花叶病毒

建立了一种基于毛细管的振荡流反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的微流控装置检测烟草花叶病毒(TMV)的新方法.根据TMV移动蛋白基因设计一对PCR引物,对粗提纯TMV颗粒直接进行RT-PCR.用0.025%小牛血清蛋白(BSA)对反应毛细管内壁进行静力学和动力学钝化,提高了PCR效率.在此微流控装置上进行RT-PCR,流速为70 μL/min时, 检出限为0.01 μg cDNA;可以在17 min内成功扩增出179 bp的目的DNA片段.     

污染土壤中主要石油降解基因AlkB和Nah定量检测方法的建立和应用

建立了SYBR Green I实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time-qPCR)检测油田污染土壤中烷烃降解基因AlkB和萘降解基因Nah的方法。比对相关降解石油菌株的GenBank序列,设计合成针对烷烃和萘降解基因扩增引物AlkBf/AlkBr和Nahf/Nahr。将纯化的常规PCR胶回收产物与pEASY-T1载体连接,转化到感受态细胞培养。提取并梯度稀释阳性克隆质粒,构建Real Time-qPCR标准测定曲线。25μL扩增体系最佳反应条件:前后引物终浓度为0.2μmol/L,12.5μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix,AlkB和Nah基因最适退火温度分别为50℃和57℃。Real Time-qPCR技术显示出很高的灵敏性和重复性,比传统PCR技术灵敏度高100倍。对采集于某油田3个功能区的14土壤样品中AlkB定量检测显示,石油污染严重的采油区含有最高的AlkB拷贝数,污染较轻的生活区AlkB拷贝数最少;Nah基因分布均匀。     

数字PCR测定DNA含量及测量结果不确定度评定

数字PCR是一项不依赖校准物的DNA绝对定量技术,将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的微室中并且进行扩增反应,通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数。采用数字PCR技术对噬菌体λDNA的含量进行测定,并对测定结果进行不确定度评定。结果显示,由数字PCR测得的λDNA的含量为(2.43±0.35)μg/管(k=2),该结果与同位素稀释质谱法测量结果相吻合。     

家蚕和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒P10基因的研究

从AcMNPV基因组DNA中克隆筛选得到含P10基因的EcoR I-P片段,以此作为探针克隆得到BmNPV P10基因片段,测定了其全核苷酸序列。PCR点突变BmNPV P10基因启始密码子ATG区,ATG突变的同时形成一个Bgl Ⅱ酶切位点,突变后的启动子及其5′端作为5′端交换臂和AcMNPV的P10基因3′端作为3′端交换臂构建成一个非融合通用转移载体pBmAcPV1.该载体可以在Sf细胞中和野生型AcMNPV DNA共转染重组表达外源基因,也可以在Bm细胞中和野生型BmNPV DNA重组表达外源基因。CAT基因在BmNPV P10 ATG突变后的启动子的控制下在家蚕细胞中得到高效表达     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

人肿瘤坏死因子(TNF)cDNA的分离、鉴定及其表达

PMA诱导的HL-60细胞株mRNA经逆转录合成cDNA;经过第一链cDNA为模板的PCR扩增反应,分离到一特异的615bp DNA片段。Southern杂交和DNA序列分析证实这一615bp片段包含了编码人TNF成熟肽所需的全部cDNA顺序。将这一人TNF cDNA克隆到大肠杆菌表达载体pKK223-3,获得人TNF直接表达质粒pHT-1。IPTG诱导的表达产物具有L-929细胞毒活性;并经抗体中和实验确证为人TNF。在A_(600)=2时,大肠杆菌产生的重组人TNF含量约为8×10~7U/1培养液。