表达5aG株狂犬病毒糖蛋白基因的重组痘苗病毒的构建及鉴定

采用同源重组的方法，将５ａＧ株狂犬病毒糖蛋白基因插入天坛株痘苗病毒基因组ＴＫ区段，置于痘苗病毒晚期启动子Ｐ１１控制之下，通过筛选，得到一株重组病毒ＶＶａＧ，实验结果表明：该株病毒可表达５ａＧ株糖蛋白基因，表达产物位于感染细胞膜表面，分子量６４×１０３，并可与抗狂犬病毒糖蛋白单抗特异结合，用ＶＶａＧ免疫小鼠，可诱导机体产生抗狂犬病毒中和抗体，抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击，中和抗体滴度在免疫后１４ｄ达到高峰，为１５６０．     

全长和截短的δ内毒素cryIAc基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

在昆虫病毒转移载体ＰＶＬ１３９３多角体基因启动子下游克隆了全长的苏芸金杆菌δ内毒素基因ｃｒｙＩＡｃ，得到了重组转移载体ｐＴｈＹ１，用ＫｐｎＩ将ｃｒｙＩＡｃ基因进行了截短，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ２．随后在两种重组转移载体ｃｒｙ基因的下游引入了ＩＥ１启动于驱动的ｎｅｏ基因作为筛选标记和ＳＶ４０小ｔ抗原终止区作为ｃｒｙ基因的终止信号，得到了重组转移载体ｐＶＬＹｌｎｅｏ和ＰＶＬＹ２ｎｅｏ，分别用两种重组转移载体ＤＮＡ与野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ共转染昆虫Ｓｆ９细胞，用Ｇ４１８筛选后经有限稀释法纯化，得到了携带全长和截短。ｒｙＩＡｃ基因的两种重组病毒ｖＶＬＹ１ｎｅｏ和ｖＶＬＹ２ｎｅｏ，分别在昆虫细胞中表达了分子量为１３３３００和８２０００的ｃｒｙ蛋白，大小分别与ｃｒｙＩＡｃ晶体蛋白和预计的截短蛋白相同，并均具有与原晶体蛋白相同的免疫活性，生物测定表明两种表达产物均具有杀虫活性，和昆虫病毒一起产生协同增效毒性．     

猪瘟病毒石门株E2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了猪瘟病毒石门株的Ｅ２基因．扩增片段大小为１１８４ｂｐ，与预期大小一致．经ＳａｃＩ酶切和巢式ＰＣＲ证实了Ｅ２基因的特异性．将Ｅ２基因扩增片段首先克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，进行全序列测定，将该基因再克隆到表达载体ｐＢＶ２２１．采用温控诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示Ｅ２基因获得表达．ＥＬＩＳＡ表明Ｅ２基因表达产物可与猪瘟阳性血清起特异性反应．     

在大肠杆菌中利用反义RNA抑制乙肝病毒（HBV）X基因的表达

将乙肝病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ株完整的Ｘ基因正向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２１的ＰＬ启动子下游，得到能表达Ｘ蛋白的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＶ（＋）；同时将Ｘ基因反向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２０的ＰＬ启动子下游，得到能转录Ｘ基因反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＸ（－）．利用这两个质粒，构建出能同时转录Ｘ基因ｍＲＮＡ和反义ＲＮＡ的重组质粒ＰＥＸ．ＡＮ－ＨＢＸ，并在原核水平上，证实了反义ＲＮＡ对Ｘ基因的表达具有明显的抑制作用，从而为在真核水平上利用反义ＲＮＡ对Ｘ基因进行调控的研究提供了有利的基础．     

伪狂犬病毒表达载体的构建

利用伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）湖北地方株胸腺核苷激酶（ＴＫ）基因和ｇＧ糖蛋白基因启动子（ＰｇＧ），构建了ＰＲＶ基因转移载体．通过β－半乳糖苷酶基因确定ＰｇＧ控制下外源基因的表达并筛选出表达β－半乳糖苷酶的ＰＲＶ重组病毒．采用ＰＣＲ对重组病毒进行了初步鉴定，证实外源基因可由构建的转移载体导入病毒ｔｋ基因中，重组的ＰＲＶ湖北地方株可用于表达外源基因．     

根癌农杆菌的高效电激转化

利用电激法将双元载体质粒ＰＢＩ１２１导入根癌农杆菌ＡＧＬ－１并获得较高转化效率．探讨了不同电激条件对转化效率的影响，并检测了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子启动ＧＵＳ基因在根癌农杆菌中的表达．结果表明：根癌农杆菌电激转化的最适电激条件为１１ｋＶ／ｃｍ，２１．５μＦ，电场强度是影响转化效率的关键因素．当质粒ＤＮＡ浓度从０．２ｍｇ／Ｌ增加至０．６ｍｇ／Ｌ时，转化效率呈线性增加．细菌密度对转化效率也有一定影响．最高转化效率为每μｇ质粒ＤＮＡ１．７×１０５转化子．组织化学反应证实ＣａＭＶ３５Ｓ能启动ＧＵＳ基因在根癌农杆菌中表达．     

一种具高活性的酪氨酸酶基因启动子片段的分离

利用大肠杆菌启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体,经ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ完全消化后与ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ部分消化的嗜麦芽假单胞菌染色休ＤＮＡ进行体外连接,转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞,在含氨苄青霉素（Ａｐ）和氯霉素（Ｃｍ）的选择平板上筛选转化子．从随机挑选的５４株转化子中,获得一株抗氯霉素水平达１０００ｍｇ／Ｌ的转化子Ｅ．ｃｏｌｉＰＡＳＩ,所含重组质粒被命名为ｐＡＳＩ．经限制性酶切分析和杂交分析表明,ｐＡＳＩ质粒上插入了一段来源于嗜麦芽假单胞菌染色体的ＤＮＡ片段,其大小为１．４ｋｂ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明转化子Ｅ．ｃｏｌｉＰＡＳＩ在含Ｃｍ的培养基上,额外表达了一条２２×１０３的ＣＡＴ蛋白质带．将重组质粒ｐＷＳＹ上的嗜麦芽假单胞菌ｍｅｌ基因亚克隆到ｐＡＳＩ上１．４ｋｂ启动子功能片段下游,构建成Ｅ．ｃｏｌｉＡＷＳ工程菌株,使黑色素产率提高了７０．６％．     

癌胚抗原启动子驱动tk基因在人肺腺癌细胞中的靶向表达

用荧光素酶报导基因,发现ｃｅａ启动子在ＣＥＡ阳性的肺腺癌细胞Ａ５４９中的活性是在ＣＥＡ阴性的宫颈癌细胞Ｈｅｌａ中的１６倍．构建了重组表达质粒ｐＣＥＡｔｋ,ｃｅａ启动子控制效应基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）的表达．转染了质粒ｐＣＥＡｔｋ的Ａ５４９细胞对甘昔洛韦（ＧＣＶ）的敏感性是未转染细胞的８６５倍,而转染了ｐＣＥＡｔｋ的Ｈｅｌａ细胞则仍保持对ＧＣＶ的抗性．结果表明：ｃｅａ启动子可用于ＣＥＡ阳性的肺腺癌等细胞的靶向性基因治疗     

温控表达载体的构建及HIV-1p24的表达与纯化

通过改造原核表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ 和ｐ Ｅ Ｔ２８,构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐ Ｖ Ｖ５,该载体携带 Ｐｒ Ｐｌ串联温控启动子以及 Ｈｉｓ Ｔａｇ 的纯化标签,利于目的蛋白的表达与纯化将 Ｈ Ｉ Ｖ１ ｇａｇ 基因的１１４８１８５７ 编码序列分别插入到ｐ Ｖ Ｖ５ｂ、ｐ Ｅ Ｔ２８ｂ 的相应位点,构建了重组表达质粒 ｐ Ｅ Ｇ１ｂ、ｐ Ｂ Ｇ７ｂ,二者在不同受体菌中,表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的 ４２％ 和２８％ 表达产物为融合蛋白并主要以包涵体的形式存在 该蛋白 Ｎ 端与含６ 个组氨酸在内的３０ 个氨基酸残基的多肽相连,利用 Ｉ Ｍ Ａ Ｃ金属螯和层析柱,对包涵体中的重组ｐ２４ 蛋白进行纯化, 其纯度超过 ８０％ ;对上清中的可溶性ｐ２４ 蛋白进行纯化,产物最终纯度超过６７％ 纯化后的重组蛋白可与 Ｈ Ｉ Ｖ１ 型标准阳性血清发生较强的免疫学反应     

一个新的杆状病毒凋亡抑制基因的克隆及鉴定

缺失功能性ｐ３５基因的苜蓿尺蠖核形多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）突变体（ｖΔＰ３５Ｋ／ｐｏｌ＋）感染草地夜蛾细胞（Ｓｆ９和Ｓｆ２１）［１］及海灰翅夜蛾细胞（ＳＬ２）［２］时，引起细胞凋亡，从而使病毒的感染流产．我们发现海灰翅夜蛾核形多角体病毒（ＳｌＮＰＶ）...     

杆状病毒p35基因延缓昆虫细胞凋亡

构建了以新霉素抗性基因为筛选标记的带有ｐ３５基因的转移载体ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ，以此载体转染Ｓｆ９细胞，经Ｇ４１８筛选得到染色体上稳定整合质粒ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ的Ｓｆ９细胞，克隆化培养后取名为Ｓｆ９－３５．经细胞原位杂交实验证明，Ｓｆ９－３５细胞的染色体ＤＮＡ上含有ｐ３５基因；经放线菌素Ｄ处理后的细胞核酸电泳检测，证实Ｓｆ９－３５具有抗凋亡特性能够支持凋亡抑制基因缺失的ｖＡｃΔｐ３５病毒复制；发现ｐ３５基因在细胞内组成型表达只能延缓ｖＡｃΔｐ３５感染及放线菌素Ｄ处理诱发的细胞凋亡的过程，而不能完全阻止其诱发的细胞凋亡．     

猪瘟病毒HCLV株E_2核苷酸序列与结构分析

用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ技术从 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ Ｈ Ｃ Ｌ Ｖ 株 Ｆ４８２ 代感染兔脾的细胞总 Ｒ Ｎ Ａ 中分段扩增出了 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ Ｅ２ 基因特异的３ 个部分重叠的 Ｄ Ｎ Ａ 片段（大小分别为 ４９９ ｂｐ、５７２ ｂｐ 和 ２４５ ｂｐ）,并将之分别克隆到ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｔ 载体上 经核苷酸序列测定和片段重叠完成了包含 Ｅ２ 全长基因的 １ １４４ ｂｐ 序列的测定,其 Ｇ Ｃ含量为４９．０％ ：核苷酸序列与国外报道的各株病毒的 Ｅ２ 基因同源性分别为８３．５％ ～９７．５％ ;其推导的氨基酸序列的同源性也分别为８９．３％～９６．２％ ,变异主要分布在 Ｅ２ 蛋白的 Ｎ 半部分     

准一维导体钾蓝青铜的光电子发射谱研究

钾蓝用青铜Ｋ０．３ＭｏＯ３的导带延拓到Ｆｅｒｍｉ能级以下约３．５ｅＶ，价带位于４～１０ｅＶ之间，除了导带与价带间的能隙不显著外，所测结果基本上符合Ｔｒａｖａｓｌｉｎｉ的模型．氧的Ｉｓ和钾的２ｐ芯能级谱中存在着弱的台阶，被理解为小能量的等离子激发．晶体结构中不等价的氧位置，导致了Ｏ－１ｓ能级谱不对称的线形式．Ｍｏ－３ｄ芯电子能谱揭示在Ｋ０．３ＭＯＯ３中存在着两种屏敝效应，以及Ｍｏ＋６，Ｍｏ＋５两种价态．     

藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达

用 Ｐ Ｃ Ｒ技术从层理鞭枝藻总 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增藻红蓝蛋白 α亚基脱辅基蛋白的基因（ｐｅｃ Ａ）, 将ｐｅｃ Ａ 克隆于ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ,然后将ｐｅｃ Ａ 基因插入表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｄ,形成的重组质粒在 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）中获得了高效表达,表达蛋白形成包涵体．高效表达的蛋白质的分子量为１９×１０３ ,与藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的分子量一致,经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 进一步证实该表达蛋白为藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白     

HaNPV穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达

ＨａＮＰＶ穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达＊朱应齐义鹏＊＊刘德立（武汉大学病毒研究所，武汉４３００７２）关键词棉铃虫核型多角体病毒，穿梭载体，绿色荧光蛋白基因分类号Ｑ７８，Ｓ８５２．６５杆状病毒表达载体被广泛用于表达各种外源基因．由于...     

麻疹病毒(Nepal毒株)H基因的序列测定及其表达

提取麻疹病毒Ｎｅｐａｌ毒株的ＲＮＡ并利用逆转录ＰＣＲ方法特异性地扩增血凝素基因（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）．将Ｈ基因克隆并测定序列，结果表明新毒株的Ｈ基因与标准疫苗毒株Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ之间存在较多重要的基因变异，两者的同源性为９８．１７％．将Ｈ基因克隆到表达载体ｐＣＤ－ＳＲα中并利用电转染法转染ＣＯＳ－７细胞，利用血凝实验检测了Ｈ蛋白的表达及功能     

SARS-CoV S蛋白的原核表达及其粘膜免疫效应

SARS冠状病毒（SARS-CoV）的S（Spike）蛋白是病毒表面最主要的膜蛋白，在病毒的感染过程中起重要作用，是冠状病毒的主要抗原．以SARS冠状病毒的cDNA为模板，通过PCR得到S△1（151～1200bp）、S△2（1201～2250bp）和S△3（2251～3150bp）3段基因序列，克隆到表达载体pET-32a，在大肠杆菌BL21中诱导表达得到包涵体蛋白，经Western blot检测正确后，将此作为抗原以滴鼻和腹腔注射两种小同的途径免疫BALB／c雌性小鼠，3次免疫之后采集小鼠的血清和肺洗液，经酶联免疫吸附实验（enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA）检测其中的抗体IgG和IgA．结果表明S蛋白通过滴鼻途径既能刺激产生一定的血清IgG，更能诱导肺粘膜产生特异IgA抗体．进一步比较分析发现，诱导粘膜免疫的效应区域主要位于S△2（401～750aa）蛋白区段．     

人脊髓灰质炎病毒感染诱发Vero细胞凋亡的研究

用人脊髓灰质炎病毒分别感染Ｖｅｒｏ细胞和稳定表达ｐ３５基因的Ｖｅｒｏ３５细胞，经细胞核ＤＡＰＩ染色，细胞ＤＮＡ琼脂糖电泳和ＴＤＴ生物素原位标记等方法证实病毒感染的细胞具有典型的凋亡细胞学特征和生物化学特征．实验结果表明人脊髓灰质炎病毒感染Ｖｅｒｏ细胞诱发的细胞死亡能被昆虫杆状病毒凋亡抑制基因ｐ３５抑制，为ＩＣＥ类蛋白水解酶途径的细胞凋亡．     

受乳糖启动子控制的基因表达过程的优化

借助于ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析方法，对乳糖诱导的由乳糖启动子控制的大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ７０因子基因表达过程进行了优化研究．结果表明，含此融合基因的大肠杆菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＥＭＤ的生长量达到ＯＤ６００ｎｍ＝１．０时，用终浓度为０．０８％的乳糖进行连续５ｈ的诱导，可使大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ７０因子基因的表达量达到最大，并达到ＩＰＴＧ同样的诱导效果．流加低浓度的乳糖溶液能增加σ７０因子的合成量，但是促进作用不很显著．     

AVM/蒙脱石复合材料的制备及吸水保水性能的研究

通过乙酸乙烯酯／顺丁烯二酸酐（ＶＭ）共聚树脂的碱解，制备了水溶性的碱解ＶＭ树脂（ＡＶＭ）．用ＣａＣｌ２将ＡＶＭ水溶与蒙脱石水悬浮体共凝胶，制备了ＡＶＭ／蒙脱石复合材料．吸水性和保水性测试结果证示：当ＣａＣｌ２用量为１０％，蒙脱石用量为１５％时，复合材料的吸水性和保水性最好．粒度测试结果表示蒙脱石在水中的粒径为０．７５μｍ，属于超微细分散．ＳＥＭ照片显示，ＡＶＭ／蒙脱石复合材料具有疏松的凝胶结构．