兴奋剂重组人促红细胞生成素及其类似物检测方法的研究进展

重组人促红细胞生成素(rhEPO)是一种激素类兴奋剂,近年来被滥用在一些耐力性比赛项目中。由于重组与内源性EPO的氨基酸序列相同,区别很小,并且在尿样或血样中的浓度低,代谢快,给检测带来了很大的难度。本文从直接方法和间接方法两个方面综述了近几年来兴奋剂rhEPO及其类似物检测的研究进展,并结合本小组的工作展望了rhEPO检测的发展方向。     

用N,N-二甲基六烷基溴化铵涂层的毛细管对重组促红细胞生长素及其酶解产物进行毛细管电泳和毛细管电泳-电喷雾质谱分析

采用毛细管电泳技术研究了重组促红细胞生长素(rhEPO)的分离问题。用N,N-二甲基六烷基溴化铵（6,6-ionene）涂层的毛细管测定了rhEPO中唾液酸的微多相性,同时采用毛细管电泳-质谱(CE-MS)联用技术在22 min内鉴定了rhEPO 20段胰酶消化肽中的11段。该方法简单快捷,重现性好,可用于蛋白质一级结构的测定。     

蚕丝蛋白用于分离富集细胞色素c的研究

近年来,固相萃取被广泛用于蛋白质分离富集,萃取剂包括离子交换树脂~([1]),纳米材料~([2]),印迹材料~([3]).蚕丝是一种天然蛋白纤维~([4]),表面含氨基、醇羟基、酚羟基等官能团,是分离富集的有效载体.实验研究了蚕丝蛋白与血红素蛋白的相互作用,发现其对血红蛋白和细胞色素c表现完全不同的吸附,即在一定条件下血红蛋白不被吸附,而细胞色素c则被完全吸附.据此建立了选择性分离细胞色素c的新体系.     

基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱研究重组人促红细胞生成素一级结构

建立了生物质谱研究rhEPO一级结构的系列方法,包括分子量、唾液酸含量以及N-糖含量等糖基化性质的测定方法,并用于4种国产rhEPO样品的分析;在此基础上优化酶切条件,使测定的肽质量指纹谱(PMF)的覆盖率均达到98%,成功鉴定了4个样品中的全部N-糖基化位点以及对分子中两对二硫键进行了结构确证,测定4个样品分子量分别为27754.1±27.4Da、27941.4±23.2Da、27682.5±22.0Da和27914.7±22.5Da;唾液酸含量分别为5.0%、4.8%、5.6%和5.4%;糖含量分别为34.3%、34.7%、34.1%和34·6%。此外还对4种产品在O-连接糖型及N-连接糖型上的区别做了初步探讨。     

Study of Immunoassay Methods for Recombinant Human Erythropoietin （rhEPO） Using Competitive ELISA

Two different immunoassay methods,competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay (CI-ELISA) and amplificative competitive indirect ELISA(ACI-ELISA) using biotin-avidin complex system were studied to detect rhEPO.The linear ranges were 50-20000ng/mL and 10-50000ng/mL for CI-ELISA and ACI-ELISA,respectively.The low detection limits of CI-ELISA and ACI-ELISA were 62.8ng/mL and 8.5ng/mL,respectively.     

以人血清白蛋白为载体的Ru(Ⅲ)和全反式维甲酸共运输纳米药物的构建及抗肿瘤转移作用

设计合成了一种以人血清蛋白纳米颗粒(HSANP)为载体, 共运输Ru(Ⅲ)配合物和全反式维甲酸(ATRA)的纳米药物Ru-ATRA-HSANP, 用于抗肿瘤转移治疗. 该药物在水中和生理条件下表现出优异的稳定性, 可以被细胞有效摄取, 具有较弱的细胞毒性, 但表现出优异的抗肿瘤转移效果. 因此, 构建了一种稳定、 低毒性的抗肿瘤转移纳米药物, 有望用于抗肿瘤转移治疗.     

酸性条件下两种马来酸-烯烃交替共聚物诱导细胞色素c的结构转换

在pH=2·9时,细胞色素c保持类天然的结构;和马来酸-烯烃交替共聚物作用后,细胞色素c的α-螺旋结构基本保持不变,但是三级结构被破坏.另一方面,在pH=2·1时,细胞色素c去折叠形成伸展的无规卷曲构象;马来酸-烯烃交替共聚物可以诱导酸变性的细胞色素c从无规卷曲构象转变为α-螺旋结构.在酸性溶液中,由于马来酸-异丁烯交替共聚物和细胞色素c之间更强的相互作用,其对蛋白质结构的影响大于马来酸-1-十四烯交替共聚物.相对于小分子,聚合物可以在低浓度条件下提供有利于蛋白质结构转换的微环境.     

毛细管电泳检测神经细胞凋亡

建立了毛细管电泳检测凋亡细胞DNA片段的方法.以DNA相对分子质量标准品为溶质,考察了分离条件(电压、进样时间、温度、聚合物浓度)对分离的影响.在优化条件下,利用毛细管无胶筛分电泳对缺氧缺血过程中不同时间点神经PC12细胞DNA片段进行了分析,并与流式细胞仪结果比较,研究缺氧缺血时胶质细胞凋亡过程.     

光/还原双重响应水凝胶微球的制备及在细胞三维(3D)培养中的应用

设计合成了一种光/还原双响应水凝胶微球, 该微球可在温和的刺激条件下实现三维(3D)细胞的大规模培养和无酶无损捕获. 水凝胶微球组分中包含一个双响应功能单体(M1), 其中邻硝基苄酯功能基团可在紫外光照下与氨基化合物发生光偶联作用, 从而在水凝胶微球表面实现黏附蛋白的有效固定, 并通过蛋白质-整合素相互作用介导细胞的黏附. 微球表面细胞生长增殖后, 其中的二硫键基团可被谷胱甘肽还原, 从而介导细胞无酶无损温和释放. 这种通过调节水凝胶微球表面生物活性分子的固定与释放介导细胞黏附与捕获的新方法为细胞工程提供了一种通用而有效的手段.     

纳米粒子在细胞自噬调控与成像研究中的应用

自噬是真核细胞的基本代谢过程之一,其作用主要是降解和清除细胞内冗余或受损的蛋白质和细胞器,循环利用胞内物质并提供能量.自噬是细胞的一种自我保护机制,同时也与细胞凋亡有着复杂的关联.在病理条件下,自噬水平的非正常上调或抑制与神经退行性疾病及肿瘤、微生物感染等疾病的发生、发展密切相关.因此,阐明自噬的过程和调控机理,并据此攻克人类疾病一直是生物医药领域的研究热点.近年来,随着纳米技术的兴起,纳米材料与自噬的关系也逐渐被揭示,本文总结了国内外有关细胞自噬的最新研究进展,并着重介绍了纳米粒子在调控自噬以及细胞自噬成像方面应用的研究进展,并对其未来的发展方向进行了展望.     

恶臭假单胞菌整细胞的腈水合酶催化特性

丙烯酰胺是一个重要的精细化工产品,其生产工艺早期采用硫酸法,因存在产品精制困难、环境污染等问题而被淘汰.近年来,美、日等国开发了使用高效铜系催化剂直接水合法来生产丙烯酰胺,目前该方法已成为丙烯酰胺的主要生产工艺,七十年代以后,国外相继开展了分离筛选水合丙烯腈生成丙烯酰胺的菌种并对具有腈水合酶的微生物细胞进行固定化的研究.近年来,我们开展了腈水合酶菌种的分离筛选和发酵条件的试验研究,分离筛选出优良菌株恶臭假单胞菌JP-1.本文报道恶臭假单胞菌游离细胞丙烯腈水合酶催化的特性.     

含氟高分子基因载体

阳离子高分子被广泛应用为非病毒类基因载体,但这类高分子材料的转染效率与细胞毒性之间通常存在"恶性"关联,即获得高转染效率时往往会伴随严重的细胞毒性.如何制备兼具高效、低毒特点的高分子载体是成功实施基因治疗的关键.含氟高分子是一类具有独特理化性质的高分子,能够在低电荷密度条件下与核酸形成稳定的复合物,从而实现高效、低毒的基因转染.含氟功能基团可帮助阳离子高分子改善复合物稳定性、细胞内吞、内涵体逃逸、胞内核酸释放等多个环节,从而赋予了含氟高分子在基因递送过程中的氟效应.该专论系统地总结了含氟高分子基因载体的研究,介绍了含氟高分子的基因递送性能、作用机理以及在基因治疗、基因编辑中的应用,并对含氟高分子载体的未来发展进行了展望.     

基于聚酰亚胺基底的细胞电融合芯片的研制

基于柔性印刷电路板(flexible printed circuits board, FPCB)技术,通过在聚酰亚胺基底薄膜表面层压的铜箔上刻蚀微电极阵列结构制备了一种细胞电融合芯片.在低电压(≤40 V)条件下实现了细胞电融合,融合效率达37%,远高于聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)法及传统细胞电融合方法.与传统细胞电融合系统相比,此芯片可在低电压条件下工作,具有结构简单、成本低廉、实验过程可观察、融合通量高等优点.另外,聚酰亚胺薄膜基底良好的柔软度可保证此芯片与其它分析模块(如细胞筛选分离模块)的有效集成,具备构造微全分析系统(micro total analytical system, μ-TAS)的巨大潜力.     

微电纯化装置用于重组人促红细胞生成素的质谱分析前样品快速除盐

利用实验室构建的微电纯化装置(Microelectro purification device,MEPD),采用电喷雾质谱正离子模式检测,在2min之内实现重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)的在线脱盐,同时和传统的C18色谱柱(150 mm×4.6 mm...     

统计学在理化检验中的应用：第四讲 测量方法的重复性及复现性

当用一个试验方法按同样的操作规程,进行重复测量和多个实验室协作进行测量时,可用重复性和复现性来表达结果的一致性程度.重复性(repeatability)被定义为在相同测量条件下,对同一被测量按方法规定的步骤,进行多次连续测量所得结果之间的一致性.这些条件称为重复性条件,它包括相同的测量程序、相同的观测者、在相同的条件下使用相同的测量仪器、相同地点、在短时期内重复测量.复现性(reproducibility)被定义为在测量条件变化下,对同一被测量按方法规定的步骤,所得测量结果之间的一致性.变化条件包括:观测者、测量仪器、地点、使用条件、时间.应当注意重复性和复现性所描述的是在各自情况下其两个单个结果所允许的差异的量度.     

含罗丹明B基团的聚天冬酰胺荧光成像探针研究

以L-天冬氨酸为原料,在体积分数为85%的磷酸催化条件下采用热缩合方法合成了聚琥珀酰亚胺大分子,用罗丹明B与乙二胺反应生成的罗丹明-乙二胺衍生物的氨基以及乙醇胺上的氨基对聚琥珀酰亚胺进行开环反应,合成了含罗丹明B基团的聚天冬酰胺大分子.通过溴化与亲核取代反应将磺胺嘧啶基团接枝于聚天冬酰胺大分子上,从而制备具有肿瘤靶向功能的水溶性聚天冬酰胺大分子荧光探针(SD-PHEA-RhB).对所合成的荧光探针进行了核磁共振谱、红外光谱、紫外-可见光谱、凝胶渗透色谱和质谱等结构表征,进一步测试了其分子量及分布、粒径、荧光性能、体外细胞毒性与细胞摄取以及荧光成像性能.实验结果表明,所合成的聚天冬酰胺荧光成像探针具有良好的水溶性和荧光性能,对酸性环境敏感,对Hep G2和HeLa细胞均具有较低的体外细胞毒性,能被HeLa肿瘤细胞选择性摄取,且能获得较好的HeLa细胞红色荧光成像.     

扫描离子电导显微镜在细胞表征中的应用研究

细胞的微观形貌、电学和力学功能在细胞生物学研究中具有重要意义.但传统细胞表征方法无法实现对活体细胞微/纳观尺度的无损、原位表征.扫描离子电导显微镜(scanning ion conductance microscopy, SICM)作为新型的扫描探针显微镜技术,由于非接触式扫描模式及纳米探针的使用,可实现对活细胞无损、高分辨地实时表征,近年来被广泛用于各种细胞生物学和细胞表征研究中.本综述主要介绍了SICM的发展历史及其在细胞表征中的应用.首先介绍SICM的仪器组成和工作原理、三种常见的工作模式及优缺点,之后分类介绍SICM在细胞生物学领域的应用进展,包括SICM在细胞形貌表征、细胞电学性质和力学性质研究中的具体应用实例,总结和比较了SICM与传统细胞生物学表征方法在细胞原位表征中的优势.最后,提出SICM在细胞表征方面面临的挑战,对其未来技术发展方向进行了展望.     

基于纳米粒子的光学细胞传感器在癌细胞研究中的应用

作为一种极为灵敏、快速的新型生物检测技术,光学细胞传感器在生物医学领域的研究应用备受关注,成为当今生物分析化学领域的研究前沿和热点.它是以细胞作为传感元件来研究信号识别、传导和指示的过程,在毒性物质、病原体等外界条件作用下,研究细胞中活性分子及其生理条件的变化,通过光学信号的变化定量分析细胞膜表面分子、胞内酶分子及微环...     

高压CO2条件下粗状假丝酵母催化苯乙酮不对称还原合成α-苯乙醇

 研究了在高压CO2条件下利用粗状假丝酵母Candida valida CICC1444活性细胞催化苯乙酮不对称还原合成(R)-α-苯乙醇. 高压CO2条件可对粗状假丝酵母细胞的活性产生一定的影响,但反应的选择性反而有所提高,证实了高压CO2作为该反应环境是可行的. 考察了底物浓度、细胞用量、反应温度和压力等因素对反应的影响. 结果表明,这些因素对反应产率有很大的影响,在最佳反应条件下,反应底物苯乙酮的转化率和产物α-苯乙醇的产率均可达90%以上,对映体过量值(ee)保持在80%左右. 与常压静置条件下的反应相比,高压CO2条件下粗状假丝酵母催化苯乙酮不对称还原反应的转化率和产率分别提高了20%和40%左右,对映体选择性也提高了5%～10%.     

DNA自组装结构在纳米诊疗中的应用

DNA分子具有良好的生物相容性和可编程性,被广泛用于构建新型纳米生物材料.研究者利用DNA纳米技术已构建了尺寸、形貌及对称性精确可控且可对环境条件做出特异性响应的DNA自组装结构,它们在生物成像及检测、药物的精准输送等纳米诊疗领域有着极大的应用潜力.然而, DNA纳米材料应用于活体系统存在稳定性不足、细胞摄取效率不高以及药物的包裹及可控释放程度不够等问题.本文简述了DNA自组装结构的构建方法以及将这些结构用于生物成像、生物检测和药物载带方面的进展,概括了提高DNA自组装结构体内稳定性及细胞摄取效率的方法,最后讨论了DNA自组装结构应用于纳米诊疗中所面临的机遇与尚待解决的问题.