纸基微流控技术及其在食品安全检测中的研究进展

纸基微流控技术（μPADs）是一种在微米尺度的纸基芯片上进行样品制备、反应、分离、检测的技 术,具有材料便宜、制作简单、易回收、结构多样、试剂消耗少、环保可降解等特点,在食品安全快速检测 领域具有实用价值。该文对纸芯片制备、流体操控及检测模式进行了介绍。首先阐述了纸芯片功能化改性方 法及生物分子的固定方式,总结了经处理后的纸张制备为二维（2D）或三维（3D）纸芯片的方法;其次论述了 流体在纸基材料上不完全浸湿和完全浸湿两个阶段的运输机理,综合分析了智能化流体操纵技术;最后介绍 了可与纸基微流控平台联用的检测方法,并综述了纸基微流控装置在食品安全检测中的应用研究进展,提出 纸基微流控技术在食品行业未来面临的挑战及发展趋势。     

色谱研究进展（第8期）

1微加工芯片液相色谱柱 基于微流控芯片构建液相色谱系统的独特优势之一,是可以利用微加工技术直接加工具有均一微结构的色谱柱。通过在芯片通道内加工形状规整的微结构(最常见的是微柱)阵列作为色谱的固定相,可显著提高色谱柱的均一性和渗透性。 最近,Detobel等报道了一种带有多孔壳层的微柱阵列色谱柱的加工方法。首先采用干法刻蚀技术在硅片上加工圆柱形微柱阵列,每个微柱的直径是2.4 μm,高度29 μm,具有很高的深宽比,微柱之间的间距为3.2 μm。整个芯片通道(即色谱柱)的宽度为1 mm,高29 μm,长约34 mm,通道的横截面积与200 μm内径的毛细管相近。利用阳极键合法将加工好的硅片与玻璃盖片实现键合。进一步采用溶胶-凝胶技术在微柱阵列表面加工多孔硅胶层,该壳层厚度为0.5 μm,因此加工壳层后的微柱直径变为3.4 μm,微柱间的通孔尺寸变为2.2 μm。最后,对色谱柱内壁表面进行水热法介孔化处理和C8硅烷化处理,完成整个色谱柱的加工。色谱柱孔隙率为66%~68%,渗透性为1.3×10-13 m2。该色谱柱被应用于两种香豆素染料的快速分离。在不到5 s的时间内,在1.6 mm长的分离柱上实现了两种香豆素染料C440和C480的快速分离。分离的塔板高度分别为3.9 μm(无保留组分)和6 μm(保留因子为6.5)。 上述方法将溶胶-凝胶整体柱加工技术与微加工微柱阵列柱技术结合起来,加工具有多孔壳层的微柱阵列色谱柱,提出了微加工色谱柱的一种新的结构模式。其优点是可分别单独控制色谱柱内通孔的大小和硅胶多孔层的厚度,因此,采用微柱阵列色谱柱可同时获得较高的分离效率和柱渗透性。详见: Anal. Chem., published on Web, 2010, 7, DOI: 10.1021/ac100971a。 2应用于快速法庭DNA分析的集成化微流控系统 微流控分析的兴起最早源于微全分析系统(μTAS)概念的提出,即在芯片上集成包括试样预处理、反应、分离和检测的所有功能单元,实现系统的集成化和微型化。但目前文献报道的微流控分析系统多数只是实现了部分功能单元的集成化,而能够实现所有功能单元集成化并将其应用于实际样品分析的报道则很少。 Hopwood等最近报道了用于快速法庭DNA分析的集成化微流控系统,在实践微全分析系统概念方面提供了一个较为成功的范例。该系统中采用一次性使用的卡盒式DNA预处理芯片,芯片上集成微泵和微阀,直接将取自分析对象口腔的样品以及试剂传输至芯片上的各种微室内,完成DNA纯化、聚合酶链反应（PCR）扩增、扩增产物的收集等操作。然后再将扩增产物传输至卡盒上方的毛细管电泳芯片上,对经过扩增的短串联重复片段进行快速分离,分离分辨率达到1.2个碱基对。采用激光诱导荧光检测器对分离后的DNA片段进行检测。然后对所得到的分离数据进行处理,得到分析对象的DNA指纹图,再将其与数据库中的DNA指纹图进行比对。全部分析过程（包括从分析对象取样到将分析结果与数据库进行比对）可在不到4 h的时间内完成。详见: Anal. Chem., published on Web, 2010, 7, DOI: 10.1021/ac101355r。 3 芯片毛细管电泳系统应用于临床分析 近日,Vanderschaeghe等报道利用商品化芯片毛细管电泳分析仪进行临床血清样品中的肝糖测定(GlycoHepatoTest),在微流控分析系统的实用化方面取得了显著进展。肝糖测定的目的是通过测定血清中一组N-多糖组分(生物标志物)的分布和随时间的变化,实现对肝脏纤维化患者的病程监测和肝硬化的早期诊断。 作者首先采用临床实验室中常见的PCR扩增仪完成血清样品的多步预处理和多糖标记操作,用时3 h。多糖的标记采用荧光标记试剂8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid, APTS)进行。其后,采用3种商品化芯片毛细管电泳分析仪（包括安捷伦公司的2100 Bioanalyzer,岛津公司的MCE-202 MultiNA System, eGene公司的改进型eGene Apparatus）对样品进行快速分析。3种仪器均获得较好的分离结果,11种APTS标记的多糖组分多数得到基线分离。其中分离速度较快者,可在2 min内完成分离,而其分离距离不到2 cm。 上述工作建立了一个实用的用于临床糖组学分析的平台,能可靠地进行临床实际血清样品的肝糖测定,对于在临床实验室开展糖组学研究以及对慢性肝病患者进行监测和早期诊断具有重要意义。此外,该系统的一个潜在的应用是在药学研究中对重组糖蛋白的糖基化进行快速筛查。详见: Anal. Chem., published on Web, 2010, 7, DOI: 10.1021/ac101560a。 4便携式臭氧分析仪 分析仪器的微型化一直是分析仪器发展的主要方向之一。如何实现分析仪器的微型化、便携化及应用的现场化,对组成仪器各部件的设计和加工均提出了很大的挑战。最近Andersen等报道了一个适用于个体化臭氧监测的便携化臭氧分析仪。分析仪基于紫外吸收原理,采用低压汞灯作为光源,光电二极管为光检测器。“U”形吸收池采用石英管、铝块和反光镜等材料搭建,检测光程为15 cm,体积为3 mL。分析仪内,采用气泵将空气样品吸入检测系统中,利用电磁阀每隔5 s交替将空气样品和经过臭氧清除器处理的空气引入吸收池。臭氧清除器的使用可消除空气中其他有紫外吸收的物质对臭氧测定的干扰。此外,在空气样品进入吸收池前,还要经过一段Nafion管,以消除空气湿度变化对测定的干扰。分析仪采用电池供电,所有部件实现全集成化,整机尺寸为10 cm×7.6 cm×3.8 cm,重量小于1 kg。 该分析仪在10 s内可完成一次样品的测定,对空气中臭氧测定的线性范围为0～500 ppbv (R2=0.9999);测定精度达到2 ppb,对臭氧的检出限(S/N=3)达到4.5 ppbv。由于在仪器研制过程中对实际环境中影响测定的因素,如温度和空气湿度等,进行了详细考察并采取了相应的解决措施,因此在实际测定过程中,分析仪的位置、温度和振动变化对测定的准确度均无明显影响。详见: Anal. Chem., published on Web, 2010, 7, DOI: 10.1021/ac1013578。     

色谱研究动态

经过近110年的发展,色谱已经成为应用最为广泛的仪器分析技术。色谱研究人员和技术人员也是当今最容易就业的一类分析化学专业人才。虽然色谱理论的发展还不是十分令人满意,但色谱技术已经相当成熟,即使上世纪80年代兴起的毛细管电泳(CE)研究热潮也已趋于平稳发展。那么,色谱研究人员还能干些什么呢?笔者通过观察和文献调研,在这里提出一些看法,供读者思考和批评。 色谱研究相对成熟的标志之一是在高水平杂志上发表的相关研究论文数目逐渐减少,比如在J. Am. Chem. Soc.(以下简称JACS)上,2009年以来发表的色谱相关论文有20余篇,但均不是直接研究色谱的,而是利用色谱作为表征技术来研究蛋白质、多肽、纳米材料、聚合物材料的。在Angew. Chem. Int. Ed.(以下简称Angew)上发表的论文也大体是这样。这说明有关色谱的基础研究目前很难产生影响整个化学学科发展的成果,虽然在Anal. Chem.这样的二级学科刊物上仍然有很多色谱研究论文发表。相比而言,在很多专业性和应用性的期刊上则有大量的色谱应用论文发表,证明色谱正在解决更多的应用问题。 那么,色谱研究人员现在在干什么呢?笔者认为可以大致分为三种情况:一部分原来的色谱研究人员转而研究微-纳流控技术或芯片实验室(还应该属于色谱范畴),这是一个非常有前途的研究领域。特别是原来从事CE研究的人员,很容易转而研究微通道(芯片)电泳。另一部分则是针对当前的热点科学问题,研究色谱技术的特殊应用。比如在蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、糖组学、脂质组学、材料科学、生命科学和环境科学等研究领域,色谱(包括CE)是必不可少的分离分析方法。不少色谱研究人员做了一些出色的工作,为相关领域的发展提供了重要的分析新技术和新方法。最近发表的工作有利用色谱作为表征技术来研究纳米材料(JACS, DOI: 10.1021/ja909133f; JACS, 2009, 131: 17093-17095, DOI: 10.1021/ja902293w)及其与其他物质的相互作用(JACS, 2009, 131: 17194-17205, DOI: 10.1021/ja9083623)、聚合物材料(JACS, 2009, 131: 13631-13633, DOI: 10.1021/ja905924u)、反应机理(JACS, 2009, 131: 16573-16579, DOI: 10.1021/ja904197q; JACS, 2009, 131: 11492-11497, DOI: 10.1021/ja9028928)、蛋白质和多肽的纯化(JACS, 2009, 131: 11306-11307, DOI: 10.1021/ja9048338; Angew, 2010, 49: 895-898, DOI: 10.1002/anie.200904413),以及复杂原油样品的分析(Angew, 2010, 49: 895-898, DOI: 10.1002/anie.200904413),等等。第三部分色谱研究人员仍然在探索创新的分离介质和方法。比如整体柱的制备与修饰、新型色谱器件和检测方法的研究。 下面介绍几篇最近发表的关于整体柱的制备与修饰、新型色谱器件和检测方法研究的论文供读者参考。 (1)整体柱功能化的新方法。整体柱的功能化目前主要采用功能化单体共聚合和/或聚合后功能化两种策略。比如硼酸盐亲和色谱(BAC)多用于含顺式二醇基团的糖或糖蛋白等生物分子的分离富集,但采用上述两种策略所得到的含硼聚合物整体柱都必须在碱性条件下工作,这可能导致生物样品的降解。为此,南京大学刘震教授研究组提出了一种新的整体柱功能化方法(Angew, 2009, 48: 6704-6707, DOI: 10.1992/anie200902469)。他们首先采用邻氨基苯基硼酸与1,6-六亚甲基二胺反应生成稳定的含B-N键的配合物,然后与环氧树脂实现开环共聚合,形成表面含有相邻氨基和苯基硼酸基团的聚合物整体柱。在中性(或碱性)条件下,相邻两基团不发生配合作用,而硼酸基团可以与待分析样品中含顺式二醇基团的物质发生配合作用。因此这类整体柱可在中性pH条件下富集(保留)含顺式二醇基团的糖或糖蛋白质,流动相变为酸性时便可将保留的物质洗脱下来。在糖蛋白组学和糖组学研究中,这类聚合物整体柱可能发挥非常重要的作用。 (2)新型高效液相色谱(HPLC)泵。迄今为止,HPLC高压泵基本都是活塞式往复泵,虽然有人研究过超声波、磁流体力学、电渗流、电动力学和电化学泵,但都不足以产生毛细管HPLC所需的压力。Pawliszyn (Anal. Chem., 1995, 67: 212-219)、Miller (Anal. Chem.,1988, 60: 1965-1968)和Hjerten (Anal. Chem., 1998, 70: 366-372)等教授的研究组曾报道过液体热膨胀泵,显示了诱人的应用前景。最近,复旦大学张祥民教授研究组在热膨胀泵研究方面取得了很好的结果(Anal. Chem., 2010, 82: 842-947, DOI: 10.1021/ac901855t)。他们首先从理论上推导了热膨胀泵的液体膨胀系数、温度、压力等因素与流速之间的关系,然后加工构建了以不锈钢膨胀室(内充水)、陶瓷管外缠绕电加热丝和热电偶构成的热膨胀泵;采用4个单元热膨胀泵和2个阀构成了梯度系统,流速范围为0.05～5.00 L/min。最后通过性能评价和氨基酸样品的梯度分析证明:该系统可用于毛细管HPLC的等度和二元梯度洗脱分析,显著降低了仪器和运行成本。 (3)气相色谱(GC)通用定量检测系统。寻找一种不用标准样品和校正过程就能实现准确定量分析的色谱检测器一直是色谱研究人员的追求,在这方面,柱后同位素稀释和电感耦合等离子体质谱(ICPMS)作为GC和HPLC的检测器已有成功的应用。但是碳在等离子体中的离子化效率很低,加上高的碳背景信号,导致了分析灵敏度不高,大大制约了该技术的应用。更重要的是ICPMS检测得不到化合物的结构信息。最近,西班牙University of Oviedo的Alonso教授研究组报道了一种GC通用的柱后碳同位素稀释定量检测系统(Angew, 2009, 48: 2561-2564, DOI: 10.1002/anie200805545),该系统不需要标准样品,也不需要校正过程,就能实现GC分离的有机化合物的准确定量分析。其原理是在GC柱后加一个燃烧反应器,将有机化合物转化为CO2,并连续加入13CO2,再用电子轰击离子化质谱（EI-MS）进行检测。这样就可实现与化合物结构无关的离子化(无论用什么离子源),进而通过同位素比实现准确定量。当不用燃烧室时,就可以获得化合物的MS结构信息。 (4)微流控反相HPLC芯片与四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF MS)联用分析磷酸化多肽。LC-MS/MS是目前蛋白质组学分析的主要技术,如何实现高丰度蛋白质的在线去除和低丰度蛋白质的在线富集是一个研究热点。荷兰Utrecht University的Heck教授研究组最近报道了他们在磷酸化多肽富集、分离和鉴定方面的研究进展(Anal. Chem., 2010, 82: 824-832, DOI: 10.1021/ac901764g)。他们采用反相-TiO2-反相HPLC芯片与Q-TOF MS联用,成功实现了大量磷酸化多肽的在线富集和鉴定。该方法用于人类白血球磷酸化蛋白组学的研究,共鉴定了1012个磷酸化多肽,相应于960个不同的磷酸化位点。 (5)集成微流控装置自动分析单细胞。单细胞分析是分析化学的前沿领域。美国University of North Carolina at Chapel Hill的Ramsey教授研究组最近报道了一种整体集成微流控装置(Anal. Chem., 2010, 82: 967-973, DOI: 10.1021/ac902218y)。该装置集成了包括溶胞部分、电泳分离通道和电渗泵驱动的电喷雾喷头,它直接连接到MS上,实现了单细胞的在线分析。作者以红细胞为模型体系,检测到了单个红细胞中的血红素和α、β亚单位血红蛋白,分析通量达到了每秒12个细胞。该装置有望用于单细胞的高通量分析。