地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因工程菌的研究进展

综述了国内外地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因工程菌的研究进展，并就基因工程菌的优缺点进行了简要分析．     

地衣芽孢杆菌YDY高产吲哚乙酸发酵条件的优化

为了得到地衣芽孢杆菌YDY高产吲哚乙酸最佳发酵条件,通过单因素实验和正交实验分别对碳源,氮源,金属离子等培养基各成分进行了优化筛选,确定最适的培养基成分及含量,同时还对其温度、pH、培养时间、接种量等培养条件进行了优化,确定了最适的培养条件.结果表明,通过优化得到了最佳培养基配方和培养条件:培养基为麦芽糖10 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl_20.1 g/L、pH为8.0,最适培养温度37℃,培养时间3 d,最佳接种量为1%.在最佳培养条件下,吲哚乙酸产量可达40μg/mL以上,与优化前相比,吲哚乙酸产量提高了约17μg/mL,达到了预期目的.     

地衣芽孢杆菌DY-1溶磷条件的研究

利用单因子试验及正交试验优化了地衣芽孢杆菌DY-1的最佳溶磷条件,并用钼锑抗比色法测定了菌株的溶磷能力.试验结果表明,以1%葡萄糖为碳源,0.1%硫酸铵为氮源时地衣芽孢杆菌DY-1溶磷量最大.最佳溶磷条件为:温度30℃,pH 8.0,培养时间72 h,3%接种量.     

苏云金芽孢杆菌MS7培养条件的优化

通过单因子试验对苏云金芽孢杆菌MS7菌株的培养条件进行优化．研究表明,该菌株的最佳培养基组成和发酵条件为：蔗糖10．0g／L、牛肉膏10．0g／L、K2HPO42．0g／L,初始发酵pH7．0,装液量25mL,培养温度35℃,培养时间36h,优化后细菌总数可达1．2×10^8CFU／mL．     

地衣芽孢杆菌营养要求的研究

本文报道了地衣芽孢杆菌的营养要求,结果表明,以葡萄糖为碳源,多种氨基酸为氮源,地衣芽孢杆菌的最佳C/N为4～4．51。满足该菌对维生素H和必须氨基酸的需要以及主要无机盐的需要时,其菌数最高为(3．55～6．7)×107/ml,可使菌数是对照的2．1～3．5倍。     

地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及原核表达

地衣芽孢杆菌(Bacillus Lichenifarmis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶(α-amylase)的优良菌株．本实验在提取地衣芽孢杆菌完整的基因组DNA序列的基础上，通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的结构基因全长1449bp，与pUCm-T载体连接转化入宿主菌DH5α中，经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌，再提取质粒与表达载体pET-28a( )酶切后连接转化入宿主菌DE3中，其阳性克隆在37℃1．0mmol/L IPTG诱导下，α-淀粉酶的基因得到了较好的表达．表达产物经SDS—PAGE鉴定，确定表达的蛋白大小为58000 Dal左右，与理论推导的分子量相一致；并初步对酶及活性及酶活最适温度和pH进行了研究。     

驱油枯草芽孢杆菌产芽孢条件优化

试验研究了采油微生物枯草芽孢杆菌的芽孢形成及萌发过程。结果表明,最适产芽孢培养基为(g/L):氯化钠5,牛肉膏5,酵母膏2,可溶性淀粉20。最适中间调控pH为9.0,最适中间调控温度为45℃。活菌总数达到1.6×10~9CFU/mL,芽孢数达到2.2×10~8CFU/mL,芽孢率为13.8%。对枯草芽孢杆菌进行3 L发酵罐研究,确定了芽孢形成的最佳搅拌转速为140 r/min,同时确定了芽孢在低转速下也可以萌发。     

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的热稳定性研究

本文研究了环境因子对液体碱性蛋白酶２７０９＾＃热稳定性的影响，多种氨基酸、低浓度的各种离子以及羟基化合物等均能提高２７０９＾＃的热稳定性，氨基酸中以丝氨酸效果最好，Ｃａ＾２＋能极大的提高酶热稳定性，多糖类对酶的热稳定性效果不明显，但与适量合用，可显著提高酶的热稳定性。     

地衣芽孢杆菌A.4041耐高温α-淀粉酶的纯化及性质

地衣芽孢杆菌A.4041（Bacillus，licheniformisA．4041）耐高温α-淀粉酶，经硫铁沉淀和垂直板制备凝胶电泳纯化，得到三种电泳均一的组分，α－Ⅰ，α－Ⅱ和α－Ⅲ．其相对质量分数分别为14.7％，32.2％和52.9％；等电点为5．2，5．4和5．5；相对分子质量为48000，55000和60000．酶作用于可溶性淀粉的米氏常数分别为4.5mg／mL，3．4mg／mL和2．6mg／mL．最适作用温度皆为90℃；最适pH为6.0～6.5；稳定pH范围皆为4～11．5在温度高于70℃，保温30min条件下，三组分的活力开始下降，但α－Ⅱ和α－Ⅲ在100℃，保温30min时仍分别保持15％和20％的残余活力，表明该酶的热稳定性良好．Ca2+，Mg2+，K+对酶明显激活；Cu2+，Fe3+，Zn2+，Al3+，EDTA、甲醛、戊二醛对酶强烈抑制．     

多粘类芽孢杆菌培养条件优化研究

对多粘类芽孢杆菌菌株B-306的培养基配方及培养条件进行优化研究,优化后的多粘类芽孢杆菌B-306培养基配方及培养条件为:可溶性淀粉17.5 g·L-1、蛋白胨25.0 g·L-1、NaCl 1.25 g·L-1、Na2HPO40.5g·L-1、CaCl21.0 g·L-1,pH7.5;培养温度30℃、转速170 r·min-1、装液量80 mL/250 mL;接种量为10%(体积分数).经过以上条件优化,多粘类芽孢杆菌B-306的细胞生物量可达5.3×109cfu·mL-1,比优化前(3.17×108cfu·mL-1)提高了15.72倍.     

基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

根据6株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的gyrB基因序列设计了1对特异性引物F1和R1,扩增产物大小为303 bp,以此引物对为基础,成功建立了灵敏度为1×10-3mg·L-1(约为200个细菌/反应)的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法 .该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,它为今后从微生物群落结构复杂的环境中分离地衣芽孢杆菌奠定了良好的基础.     

地衣芽孢杆菌降解茶皂素的研究

以茶皂素(tea saponin)为原料,以茶皂素降解率为指标,利用地衣芽孢杆菌降解茶皂素.分别探讨发酵时间、发酵温度、摇床转速、接种量对其降解的影响,再通过响应曲面设计实验对发酵条件进行优化.结果表明,影响降解率显著性次序为:发酵温度(X2)接种量(X4)发酵时间(X1)摇床转速(X3),得到最佳的优化条件为:发酵时间10.9d,发酵温度28.89℃,摇床转速150r·min-1,接种量为9.11%.在此条件下发酵茶皂素的降解率达到了(63.83±0.28)%.     

Adsorption and reduction of palladium (Pd2+) by Bacillus licheniformis R08

Preliminary study on the mechanism of Pd2+ biosorption by resting cells of Bacillus licheniformis R08 biomass has been carried out by means of chemical kinetics and AAS, TEM, XRD and FTIR methods. The results showed that at 30℃ and pH 3.5, when dry R08 biomass powder (800 mg/L) was mixed with Pd2+ (100 mg/L) for 45 min, the rate constant k of biosorption of Pd2+ attained a maximum of 5.97×10-2 min-1 and the half life period of the reaction reached 12 min. The part of Pd2+ adsorbed by R08 biomass was reduced to elemental, cell-bound Pd0 at the same condition. The cell wall of R08 biomass was the primary location for accumulating Pd2+, and aldoses, I. E. Hydrolysate of a part of polysaccharides on the peptidoglycan layer in the acidic medium, serving as the electron donor, in situ reduced the Pd2+ to Pd0.     

一株地衣芽孢杆菌脲酶生产的发酵优化和酶学性质

对中国南海海绵Halichondria regosa中分离得到脲酶产生菌Bacillus licheniformis B81进行脲酶生产的发酵条件优化;并对其脲酶特性进行测试。通过对基础培养基筛选后,对选定基础培养基进行了Plachett-Bunman重要因素筛选,最终选定的重要因素通过单因素实验得到了最终的培养基配方为:葡萄糖25 g/L,蛋白胨12.5 g/L,牛肉膏5 g/L,酵母粉6.5 g/L,KH2PO42 g/L,NaCl 1 g/L,尿素0.625%(W/V),Ni(NO3)20.006 25%(W/V),H2O 1 L。优化后,使得脲酶的产量提高到了原培养基的170%。菌株所产生的脲酶的最适反应pH为7.0,最适温度为40℃,Pb2+、Cu2+对脲酶活性具有抑制作用。     

Bt培养基配比及伴孢晶体纯化条件的优化

苏云金芽孢杆菌[Bt(HD-1)]发酵中培养基的配方影响发酵水平,还决定发酵产物杀虫毒力的效果.本实验在基础参数试验基础上,采用均匀设计法对Bt发酵中培养基组分、杀虫晶体蛋白纯化条件进行优化,并直接采用发酵中伴孢晶体量作为最终评价指标.结果表明:Bt培养基成分对发酵的主要影响因素依次为:MgSO4、蛋白胨、可溶性淀粉,最佳用量为(g/L):1.3、2.6、4.5;晶体蛋白双液相纯化的主要影响因素依次为:K2HPO4/KH2PO4质量比、PEG浓度、沉淀量、离心速度,最佳条件为:3:1、110 g/L、1 g、1 440 r/min,其中离心速度若选500 r/min,可能对晶体纯度提高更有利,但低速对回收率有负影响.     

盐度、温度和pH对2株海南地衣芽孢杆菌相对蛋白酶活性的影响

采用脱脂牛奶平板法,测定了不同盐度、温度和pH对2株分离白海南热带海水养殖系统的地衣芽孢杆菌（Bacillus lichen@rmis）Pb．WC09001和Pb—WC09002的相对蛋白酶活性的影响．结果表明：随着盐度的增加,2个菌株的相对蛋白酶活性都趋于减弱,当盐度增加到50时,仅Pb-WC09001还存在一定的酶活性,其相对蛋白酶活性为1．56U·mL-1,说明Pb—WC09001对高盐度环境的适应性更强．此外,还测定了在18～38℃（以4℃为梯度差）范围内菌株的相对蛋白酶活性,当在与菌体培养相同的温度下测定培养液的酶活时,Pb-WC09001与Pb—WC09002酶活性最高的温度均为34℃;当在30℃测定2个菌株在不同温度下的培养液酶活时,酶活性最高的培养液所对应的培养温度分别为22℃和30℃,说明这2个菌株在相同温度下可产生不同的蛋白酶,同时,Pb-WC09001在低温环境下的相对酶活性强于Pb-WC09002．在30℃、盐度30、菌体终浓度为2×10^3／mL时,Pb-WC09001在pH8．0、Pb—WC09002在pH7．5时的酶活性最高,相对酶活均为2．74U·mL-1,因此,Pb-WC09001对海水环境（pH8．0—8．4）的适应性更强．     

接种地衣芽孢杆菌发酵的普洱茶品质与微生物群落分析

为通过接菌发酵提高普洱茶的品质,将从普洱茶中分离鉴定到的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)L1接种于灭菌和未灭菌的晒青茶中,分别进行纯菌发酵与强化发酵。结果表明:纯菌发酵后茶叶中茶多酚质量分数和5种儿茶素[儿茶素(C)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、儿茶素没食子酸酯(CG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)]质量比较自然发酵显著降低(P<0.05),茶褐素质量分数显著增加(P<0.05)。与自然发酵相比,强化发酵中茶褐素[(6.75±0.13)%]、茶红素[(1.04±0.09)%]和可溶性糖[(5.76±0.10)%]质量分数显著升高 (P<0.05);而CG[(0.39±0.03)mg/g]、表儿茶素[(0.86±0.05)mg/g]、GCG[(0.20±0.03)mg/g]、 C[(2.28±0.14)mg/g]、表没食子儿茶素[(1.69±0.11)mg/g]、EGCG[(0.33±0.02)mg/g]6种儿茶素质量比显著降低(P<0.05)。强化发酵茶汤甜味(3.33±0.78)和厚重感(6.11±0.71)感官评分增加,苦味(1.33±0.50)、涩味(0.67±0.50)和酸味(0.33±0.44)分数降低。色差仪检测发现,强化发酵茶汤的a*值(25.70±0.68)、b*值(77.06±1.07)增加,L*值(71.58±0.83)降低。细菌16S rRNA和真菌ITS序列的扩增子测序发现,地衣芽孢杆菌L1在整个过程中并未一直是优势细菌(发酵中后期仅为0.2%~0.5%),但改变了微生物群落结构,表现在短杆菌(Brevibacterium)、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys adeninivorans)和Rogersella griseliniae的相对丰度显著升高(P<0.05);而无色杆菌(Achromobacter)、伯克氏菌(Burkholderia)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、欧文氏菌足杆菌(Erwinia)、埃希氏菌(Escherichia)、克雷白氏菌(Klebsiella)和微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)7种微生物的相对丰度显著降低(P<0.05)。因此,接种地衣芽孢杆菌L1发酵普洱茶,可能通过与其他微生物的协同作用改变茶叶中的特征成分,从而提高普洱茶的感官品质。  收稿日期:2021-08-09 基金项目:国家自然科学基金资助项目(31760225;32160728);云南省高层次人才培养计划青年拔尖人才专项(YNWR-QNBJ-2018-366);云南省科技厅科技计划项目(202104BI090008)。 第一作者:刘琨毅,男,副教授,博士,主要从事传统发酵食品方面的研究。 *通信作者:赵 明,男,教授,博士,主要从事茶叶生物化学方面的研究。     

响应面设计法优化腺苷发酵培养基

利用响应面方法对枯草芽孢杆菌生产腺苷的培养基进行了优化。首先用两水平因子实验对培养基组分酵母粉、玉米浆、KH2PO4、MgSO4、(NH4)2SO4对产苷的影响进行评价,结果表明：主要影响因子为酵母粉、KH2PO4和(NH4)2SO4。根据实验结果对主要影响因子的大致范围进行估计,选定合适的浓度作进一步试验,然后用中心组合设计及响应面分析确定主要影响因子的最佳浓度。通过实验发现当酵母粉15g／L,KH2PO4 6g／L,(NH4)2SO4 10g／L时,腺苷产量达到7．42g／L,比优化前的5．77g／L提高了28．6％。     

洗毛用枯草芽孢杆菌产蛋白酶发酵条件优化

 用响应面法(Response Surface Methodology,RSM)对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）液体发酵产蛋白酶的发酵条件进行快速优化。首先运用逐因子试验确定Bacillus subtilis产蛋白酶的最佳碳源和氮源分别为糊精和玉米粉。在此基础上,通过Plackett-Burman设计对影响其产酶相关因素进行评估,并筛选出具有显著效应的3个因素：糊精、玉米粉和酵母膏。在用最陡爬坡试验逼近以上3个因子的最大响应区域后,采用RSM法对以上3个显著因子的最佳水平范围进行研究,通过对二次多项回归方程求解,确定其最优发酵条件为：糊精11.568g/L,玉米粉22.462g/L,酵母膏10.202g/L,NaCl 5g/L。初始pH值为7.0,37℃培养48h。最终优化后的酶活达到3281.79U/mL,比初始酶活2463.95U/mL提高了33.19%,证明RSM法优化洗毛用Bacillus subtilis产蛋白酶发酵工艺是可行的。