蛋白质组学中质谱分析前的预富集研究进展

回顾了近年来生物质谱分析鉴定蛋白质及多肽前的预富集方法研究进展,其中包括固相微萃取富集方法、靶上富集方法、电洗脱富集方法以及磷酸化蛋白质/肽段的富集方法,总结和归纳了各种方法所具有的优缺点,引用文献59篇。     

基于离心式富集装置的酪氨酸磷酸肽分析新方法

酪氨酸磷酸化及其相应激酶活性的研究在抗肿瘤药物靶点的研发中具有重要意义.由于酪氨酸磷酸化仅占蛋白质总磷酸化含量的不足0.1%,因此规模化的酪氨酸磷酸化鉴定面临着重大技术挑战.本研究构建了TiO2串联C18反相填料的离心式富集装置,结合抗体免疫沉淀法,建立了酪氨酸磷酸肽的富集策略.此新型富集装置由吸头、适配器和离心(EP)管组成,将TiO2富集磷酸肽和C18填料反相分离磷酸肽有机结合,以离心的方式进行样品的上样、清洗、洗脱和分离,再通过抗酪氨酸磷酸化抗体进一步特异性富集酪氨酸磷酸肽,从而实现了酪氨酸磷酸肽的高效富集和大规模质谱鉴定.通过离心式富集装置简化了实验步骤,减少了样品损失和人为因素干扰;而且离心式、平行化的样品处理方式可显著提高分析通量.将此策略成功用于小鼠肝脏蛋白质酪氨酸磷酸化肽段的富集和质谱鉴定,在5 mg鼠肝蛋白中共鉴定出967个酪氨酸磷酸化位点,对应545个蛋白质,显示了其在蛋白质组学研究中的应用潜力.     

磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展

蛋白质的磷酸化是一种可逆性的翻译后修饰,在细胞的增值、分化、信号转导以及转录与翻译调控、蛋白质复合体的形成、蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用.因此磷酸化蛋白的鉴定成为翻译后修饰研究的重要内容.但由于磷酸化蛋白的丰度较低, 难以用质谱直接检测.为了解决这个问题,改善质谱对磷酸肽的信号响应, 需要对磷酸化蛋白质或磷酸肽进行富集.本文系统地介绍了磷酸化蛋白组学研究中应用较为广泛和最新建立的各种分离富集方法的原理、特点、应用研究进展,包括抗体富集法、激酶特异富集法、亲和富集法、化学修饰法、多种色谱分离富集方法以及MALDI靶盘富集法.     

串级质谱应用于蛋白质科学研究的实例介绍

串级质谱（MS/MS）分析是近年来迅猛发展的仪器分析技术,对于化学相关学科与其他交叉领域都起到了极大的推动作用。在使用计算机辅助解析后,常常需要进一步进行图谱指认,而这部分内容常常被化学教学所忽略。从串级质谱的原理出发,详细分析了肽段在二级质谱中可能的断裂模式与结构特性,并进一步以模型蛋白为例详细分析了串级质谱的图谱指认和峰的归属的基本原理与实用性方法,以期对教学与科研有助。     

蛋白质半胱氨酸上的翻译后修饰组分析方法进展

半胱氨酸的巯基具有很高的反应活性,作为亲核、氧化还原催化反应、金属结合及变构调节位点等在蛋白质的结构和功能中发挥着非常重要的作用,且容易发生多种翻译后修饰,调控亦或损伤蛋白功能,与人类许多重要疾病关系密切,因此,定性与定量分析蛋白质半胱氨酸上的翻译后修饰组对理解其生物学功能具有重要意义。本文综述了近年来蛋白质半胱氨酸上常见的翻译后修饰组的质谱和蛋白质组学分析方法进展。     

单颗粒-电感耦合等离子体质谱测定海水中银纳米颗粒

建立了单颗粒-电感耦合等离子体质谱法(SP-ICP-MS)量化与表征海水中银纳米颗粒(AgNPs)的方法。筛选了SP-ICP-MS检测海水中AgNPs时的最优驻留时间,通过探究海水基质对AgNPs检测的影响,确定了海水样品稀释倍数,并利用本方法对大连市近岸海域3个站位表层海水样品中的AgNPs进行测定。结果表明,仪器最优驻留时间为100μs, 150倍稀释海水样品可提高AgNPs浓度的测定准确度。本方法测定海水中AgNPs数量浓度检出限为9.75×10³ particles/mL,粒径检出限为12 nm,标称粒径50和100 nm AgNPs的平均加标回收率均大于70%。大连市近岸海域3个站位表层海水样品中均检测出AgNPs,数量浓度最大值为(2.1±0.004)×10⁶ particles/mL,最小值为(1.1±0.01)×10⁵ particles/mL,粒径分布在18～200 nm之间。本方法具有样品制备简单、分析速度快、颗粒物数量浓度检出限低等优点,为近岸海水中AgNPs的监测分析提供了可靠的分析方法。     

基于纳米粒子的糖蛋白/糖肽分离富集方法

蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,糖基化对蛋白质的结构和功能有着非常重要的影响。在血清或者组织提取液中,一些低浓度的糖蛋白/糖肽是具有高度临床灵敏性和特异性的生物标记物,这些生物分子可能对疾病发生机理探讨、疾病标记物发现及蛋白类新药开发提供重要信息。由于糖蛋白/糖肽的丰度低,从复杂的生物样品中高选择性富集糖蛋白/糖肽一直是糖蛋白组学的难点和重点。纳米结构的材料因其大比表面积、丰富的活性亲和位点和特殊结构,已经广泛应用于糖蛋白/糖肽的分离富集中。本文对基于金、SiO₂、TiO₂、Fe₃O₄、金刚石和聚合物纳米粒子为载体的糖蛋白/糖肽分离富集方法的研究进展作了简要概述,并且阐明了糖蛋白/糖肽分离富集方法所面临的挑战,最后,对其未来发展方向做了展望。     

ZnO、CuO和NiO纳米颗粒在基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析小分子化合物中的应用

考察了过渡金属氧化物ZnO纳米颗粒直接作为无机基质,应用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( MALDI-TOF-MS)法分析糖类、硬脂酸小分子物质的效果;同时以L-精氨酸为目标分析物,初步探讨了CuO和NiO两种纳米颗粒直接作为无机基质,对L-精氨酸选择性离子化的可行性。实验中,将待分析物与纳米颗粒悬浮液直接混合于样品板上,自然蒸干溶剂形成结晶状,采用337 nm波长的紫外激光辐照激发,在反射模式的TOF-MS条件下检测分析。结果表明, ZnO纳米颗粒作为一种半导体材料,具有较强的紫外吸收,可直接作为无机基质,能够避免使用传统基质带来的干扰,简化质谱图,尤其在负离子模式下能够提高硬脂酸离子化的峰强度。此外,通过比较CuO和NiO纳米颗粒对于L-精氨酸分析检测结果的差异性,初步实现了Cu+对L-精氨酸的选择性检出。     

尺寸排阻-反相液相色谱-质谱联用技术在大鼠肾脏翻译后修饰蛋白质鉴定中的应用

LC-MS联用技术在蛋白质组学研究中具有重要的作用,但是在复杂的生物体系中,由于样品的高度复杂性和其中蛋白质含量的巨大差异,执行全面且无倾向的蛋白质组分析是一项挑战。因此,在液相色谱分离中采用基于不同原理的色谱分离方法来降低蛋白质样本的复杂度,并对微量蛋白质进行富集,对后续采用质谱方法进行信息的采集和深入分析至关重要。在这里我们开发了一种基于尺寸排阻色谱(SEC)与反相液相色谱(RPLC)结合的新方法来进行复杂体系蛋白质的分离和鉴定,特别是对于微量蛋白质的分析。首先使用SEC对蛋白质进行分离和富集,并酶解成多肽,再通过RPLC-MS联用的方法对酶解后的多肽进行分离和鉴定。结果显示使用上述方法可以有效降低蛋白质样本的复杂度,并有效提高微量蛋白质的鉴定能力,可从大鼠肾脏鉴定出23621个肽段及1345个蛋白质,比常规的二维强阳离子交换-反相液相色谱法(2D SCX-RPLC)鉴定到的肽段及蛋白质分别多出69%及27%。此外,该方法对肾脏翻译后修饰(PTM)蛋白质的鉴定显示出更多的优势,翻译后修饰的多肽鉴定率显著增加,特别是磷酸化肽段的鉴定效率可达到靶向富集策略的水平。在此展示的SEC-RPLC-MS可以更好地了解蛋白质翻译后修饰对肾脏的影响,最终将有助于增加我们对正常的生理性肾功能以及病理过程机制的理解。     

小尺度4-巯基苯硼酸修饰纳米金粒子用于大鼠肝脏糖蛋白选择性富集和质谱鉴定研究

报道了利用硼氢化钠还原一步法合成小尺度巯基苯硼酸修饰的纳米金材料（尺寸约为3 nm）,合成方法简便快捷.利用纳米金表面的硼酸基团与糖蛋白/糖肽中顺式邻二羟基的酯化反应,成功实现了糖肽和糖蛋白的选择性富集.利用该材料对糖蛋白HRP酶解产物进行富集,经富集后糖肽质谱峰的信号强度提高近百倍;将该材料用于大鼠肝脏中糖蛋白的富集...     

金纳米颗粒修饰的共价有机框架材料用于基质辅助激光解析/电离质谱分析小分子

利用金硫键相互作用将金纳米颗粒固定在带有硫醚悬臂的二维共价有机框架(TTB-COF)上,制备了一种金属有机复合材料(Au-TTB-COF),用于基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)分析小分子物质。与前期报道的基质相比,Au-TTB-COF将COF材料对紫外光的吸收和金纳米颗粒所具有的促进激光能量转移作用相结合,提高了分析物的电离效率,显著提高了小分子MALDI-MS分析的灵敏度。同时,Au—S键的稳定性有效降低了基质背景干扰,提高了分析的重现性和耐盐能力。实际样品的分析结果表明,对富含大分子物质组分的血清和牛奶样品以及富含电解质的果汁,以Au-TTB-COF为基质均可实现样品中小分子的MALDI-MS分析。     

氧化铁纳米颗粒在磁共振成像中的应用

目前临床诊断中钆基造影剂的应用十分广泛,然而其对人体的毒性无法忽视,因此研究者致力于低毒性造影剂的研发。氧化铁纳米颗粒(Iron Oxide Nanoparticles,IONP)因其超顺磁性在磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)中具有良好的暗对比效果,并且具有良好的生物相容性。随着生物材料和分子影像技术的发展,IONP在MRI成像中的应用愈发广泛。近年来,IONP在多模态成像和诊断治疗一体化方面取得了进展。本文将以IONP的MRI成像机理、制备和表面修饰为基础,阐述近年来IONP在MRI成像应用的研究成果和问题,期望IONP取得更好的发展。     

基于分子信标探针和生物功能化纳米颗粒的蛋白质分析

随着人类基因组测序计划的完成,生命科学研究热点逐渐由基因组学向蛋白质组学转移.分析化学工作者利用分子信标探针和生物功能化纳米颗粒的固有优势,发展了一系列新原理、新方法和新技术并在蛋白质组学研究领域得到了广泛应用,极大地促进了蛋白质组学的发展和进步.本文主要综述了基于分子探针和生物功能化纳米颗粒开展的一系列实时、原位、灵敏、特异的蛋白质分析研究,包括:非特异性/特异性蛋白质的检测与分离、蛋白质/DNA相互作用研究、细胞表面蛋白质的识别,以及基于抗原-抗体反应的病原菌检测等,并进一步展望了基于分子信标探针和生物功能化纳米颗粒的蛋白质分析研究的发展前景与关键问题.     

毛细管电泳-质谱联用技术及其在蛋白质组学中的应用

蛋白质组学研究在生物学、精准医学等方面发挥着重要的作用。然而研究面临的巨大挑战来自生物样品的复杂性,因此在质谱（MS）鉴定技术不断革新的同时,发展分离技术以降低样品复杂度尤为重要。毛细管电泳（CE）技术具有上样体积小、分离效率高、分离速度快等优势,其与质谱的联用在蛋白质组学研究中越来越受到关注。低流速鞘流液和无鞘流液接口的发展及商品化推动了CE-MS技术的发展。目前毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等电聚焦（CIEF）、毛细管电色谱（CEC）等分离模式已与质谱联用,其中CZE-MS应用最广泛。目前被广泛采用的蛋白质组学研究策略主要是基于酶解肽段分离鉴定的"自下而上（bottom-up）"策略。首先,CE-MS技术对酶解肽段的检测灵敏度高达1 zmol,已成功应用于单细胞蛋白质组学;其次,毛细管电泳技术与反相液相色谱互补,为疏水性质相近的肽段（尤其是翻译后修饰肽段）的分离鉴定提供了新的途径。基于整体蛋白质分离鉴定的自上而下"top-down"策略可以直接获得更精准、更完整的蛋白质信息。CE技术在蛋白质大分子的分离方面具有分离效率高、回收率高的优势,其与质谱的联用提高了整体蛋白质的鉴定灵敏度和覆盖度。非变性质谱（native MS）是一种在近生理条件下从完整蛋白质复合物水平上进行分析的质谱技术。CE与非变性质谱联用已被尝试用于蛋白质复合体的分离鉴定。该文引用了与CE-MS和蛋白质组学应用相关的93篇文献,综述了以上介绍的CE-MS的研究进展以及在蛋白质组学分析中的应用优势,并总结和展望了其应用前景。     

金属纳米颗粒制备中的还原剂与修饰剂*

金属纳米颗粒由于其独特的光学、电学、化学性质以及各种潜在的应用价值,受到不少研究人员的广泛关注。实现金属纳米粒子尺寸、形貌可控,改善粒子分散性和稳定性,提高产率及纯度已成为具有挑战性的研究课题,不断发展和完善金属纳米粒子的合成方法则显得尤为重要。本文总结了目前制备金属纳米材料的几种化学方法：化学试剂还原法、电化学还原法、辐射还原法等,分类介绍了化学试剂还原法中常用的无机、有机还原剂,以及含氮、磷、羧基、巯基小分子有机化合物以及高分子聚合物等修饰剂并重点总结了其还原和修饰机理。     

智能聚合物基材料富集磷酸化肽和糖肽的研究进展

翻译后修饰是蛋白质组学研究的前沿和重点,它不仅调节着蛋白质的折叠、状态、活性、定位以及蛋白质间的相互作用,也能帮助科学家更全面地了解生物体的生命过程,为疾病的预测、诊断和治疗提供更加强大的支撑和依据。翻译后修饰产物(例如磷酸化肽和糖肽)丰度很低,且存在着强烈的背景干扰,很难直接用质谱进行分析,因此迫切需要开发高效的富集材料和技术来选择性富集翻译后修饰产物。近年来,智能聚合物基材料通过外部物理、化学或生物刺激可逆地改变其结构和功能,实现对磷酸化肽和糖肽高度可控的吸附和脱附,进而衍生开发出一系列新颖的富集方法,极大地吸引研究者们的兴趣。一方面,智能聚合物基材料的响应变化包括材料疏水性的增加或减少、形状和形貌的改变、表面电荷的重新分布以及亲和配体的暴露或隐藏等特性。这些特性使得目标物和智能聚合物基材料之间的亲和力可以通过简单改变外部条件(如温度、pH值、溶剂极性和生物分子等)实现更可控和更智能的精细调节。另一方面,智能聚合物基材料为集成功能模块提供了便捷的可扩展平台,例如特定的识别组件,显著提高了目标物质的分离选择性。智能聚合物基材料在分离方面展现出巨大的潜力,这为蛋白质翻译后修饰产物的分析和研究带来了希望。围绕上述主题,该文依据Web of Science近20年来近50篇代表性文献,概述了智能聚合物基材料在磷酸化肽和糖肽分离及富集中的发展方向。     

伴刀豆凝集素修饰磁性纳米粒子富集人血清中糖蛋白及质谱鉴定

发展了一种新型的磁性纳米粒子应用于人血清中特异性糖蛋白的亲和富集。制备的磁性纳米粒子具有核/壳/壳结构,即由Fe₃O₄磁性粒子/硅胶层/有机聚合物外层构成。伴刀豆凝集素A（Con A）以共价键合的形式通过短链聚乙二醇固定在粒子表面,实现了人血清中特异性糖蛋白的高效富集。富集的蛋白经过胰蛋白酶酶解后,所得的肽段经离线的二维色谱分离,用高分辨质谱共鉴定出80种蛋白。通过NetNGlyc等搜索软件分析确定其中76种为糖蛋白,分析发现在血清中质量浓度仅为0.00001 g/L的 β -2-glycoprotein 1也得到了鉴定,表明我们发展的磁性纳米粒子与凝集素相结合的方式,可以高效地富集复杂体系中与主要蛋白成分含量相差12个数量级的低丰度糖蛋白。     

预富集装置在QCM传感器检测芥子气中的运用

在化学战剂的诸种检测方法中, 质量型微传感器以其响应快速、使用简便等优点成为一种理想的检测手段. 但是这种传感器的使用往往受到检出限的限制, 对于低浓度的毒剂不能及时报警. 预富集技术的运用可以提高微传感器的检测限. 本文研制了一种预富集装置并对其进行了初步测试. 芥子气通过此预富集装置之后在QCM(石英晶体微天平)传感器上的检出限可以达到0.1 mg/m3.