基于纳米金胶标记DNA探针的电化学DNA传感器研究

以纳米金胶为标记物,将其标记于人工合成的5-端巯基修饰的寡聚核苷酸片段上,制成了具有电化学活性的金胶标记DNA电化学探针;在一定条件下,使其与固定在玻碳电极表面的靶序列进行杂交反应,利用ssDNA与其互补链杂交的高度序列选择性和极强的分子识别能力,以及纳米金胶的电化学活性,实现对特定序列DNA片段的电化学检测以及对DNA碱基突变的识别.     

基于纳米金膜和稳定Y型结构的DNA电化学传感器

利用纳米金膜(GNF)和稳定的Y 型DNA 成功构建了一种具有良好选择性和较低检测限的DNA 传感器. 首先将金电极快速氧化后还原制成GNF, 利用Au-S 键将捕获探针DNA (c-DNA)有效地固定到GNF 电极表面, 在目标物存在的情况下, 将其与标记有亚甲蓝(MB)的指示探针(r-DNA)杂交形成Y 型结构. 利用GNF 独特的纳米性质和形成的Y型DNA 结构特点, 使MB 接近GNF, 从而提高了电子传递速率, 以差分脉冲伏安法(DPV)实现DNA 特定序列的检测,检测线性范围为1.0×10^-12～1.0×10^-9 mol/L, 检测下限为2.4×10^-13 mol/L. 与传统的传感器相比, 本方法提高了选择性, 减小了背景电流. 此外, 该传感器表现出良好的重现性和稳定性.     

纳米粒子在电化学DNA生物传感器研究中的应用

简要介绍了电化学DNA生物传感器的原理和分类,对纳米粒子在电化学DNA生物传感器研究中的应用进行了详细评述.     

基于不同电化学探针检测乳腺癌基因片段电化学传感器的研究

构建了以3种不同电活性物质(铁氰化钾平衡电对、亚甲基蓝和六氨合钌)为电化学信号探针,检测乳腺癌基因片段(乳腺癌DNA)的电化学传感器。利用吸附作用将探针ss DNA固定于金纳米-多壁碳纳米管-Nafion复合纳米材料修饰金电极表面,制备了DNA电化学传感器。采用循环伏安法、电化学阻抗法和微分脉冲伏安法,对DNA电化学传感器进行表征和定量分析。实验结果表明,在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]-5mmol/L K4[Fe(CN)6]平衡电对电化学探针检测液中,乳腺癌DNA的线性范围为0.1~500.0 nmol/L,其检出限(S/N=3)为0.03 nmol/L。以20μmol/L亚甲基蓝为电化学探针检测液时,乳腺癌DNA的线性范围为1.0~500.0 nmol/L,检出限为0.3 nmol/L。利用50μmol/L六氨合钌电化学探针检测时,乳腺癌DNA的线性范围为1.0~500.0 nmol/L,检出限为0.3 nmol/L。3种电化学探针中,利用铁氰化钾平衡电对探针检测乳腺癌DNA的检出限最低,线性范围最宽。该传感器可用于其他DNA的检测分析。     

基于结构变化适体及信号探针DNA修饰的Au纳米粒子放大作用的腺苷电化学传感器

适配体（aptamer）是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术（SELEX）,从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性的结合,被广泛应用于生物传感器、药物检测、医学诊断和治疗等方面。青岛科技大学化学与分子工程学院张书圣课题组将纳米技术与适配体技术结合,研制成功一种新型的腺苷分子传感器（Anal．Chem．,2008,80：8382-8388）。     

基于纳米金探针和基因芯片的DNA检测新方法

运用荧光纳米金探针和基因芯片杂交建立一种新的DNA检测方法. 荧光纳米金探针表面标记有两种DNA探针: 一种为带有Cy5荧光分子的信号探针BP1, 起信号放大作用; 另一种为与靶DNA一部分互补的检测探针P532, 两种探针比例为5∶1. 当靶DNA存在时, 芯片上捕捉探针(与靶DNA的另一部分互补)通过碱基互补配对结合靶DNA, 将靶DNA固定于芯片上; 荧光纳米金探针通过检测探针与靶DNA及芯片结合, 在芯片上形成“三明治”复合结构, 最后通过检测信号探针上荧光分子的信号强度来确定靶DNA的量. 新方法检测灵敏度高, 可以检测浓度为1 pmol/L的靶DNA, 操作简单, 检测时间短. 通过改进纳米金探针的标记和优化杂交条件, 可进一步提高核酸检测的灵敏度, 这将在核酸检测方面具有重要的应用价值.     

基于生物功能化纳米DNA探针及其传感策略

随着人类基因组计划的完成和功能基因研究的深入,基因诊断已成为分子生物学和生物医学的重要研究领域。DNA生物传感器作为一种利用核酸碱基配对原则进行识别,能对基因片段实现持续、快速、灵敏和选择性检测的新方法,近年来发展非常迅速。纳米材料由于具有独特物理化学性质、良好的生物相容性、优越的机械性能及表面易于生物功能化等特点,被广泛应用到生物分析之中。各种各样组成、尺寸、维度及形状的纳米材料如量子点、贵金属纳米材料、碳纳米材料等被可控地修饰上不同的生物分子,用于发展特殊性质的纳米探针,构建DNA生物传感器,实现对DNA片段高灵敏及高特异性的检测。     

纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒DNA的检测

利用两组探针修饰的微粒:(1)表面标记有可与待测乙肝病毒(HBV) DNA另一端结合的纳米金探针1(信号探针)以及可与信号探针部分结合的纳米金探针2(检测探针);(2)表面标记有可与待测HBV DNA一端结合的磁珠探针(捕捉探针1).检测靶HBV DNA时,磁珠探针与信号探针在液相中可分别与HBV DNA靶序列一端结合最终形成三明治样结构.再以磁场将三明治样复合物从反应液中分离,以DTT溶液将信号探针从纳米金颗粒上洗脱.洗脱后的信号探针数量反映靶基因的多寡,信号探针一段与预先点样的基因芯片上的捕捉探针2结合,检测探针与信号探针另一段相结合,最后用银染液将检测探针显色从而得到靶目标DNA相对定量信息.结果表明,本检测方法的检测灵敏度达到10-15 mol/L水平.检测时间少于1.5 h,检测结果与HBV DNA水平呈现较好的线性关系且无假阳性结果;本方法有望用于乙肝病人血清中HBV DNA的快速筛测及其它微生物基因的检测.     

基于三维DNA纳米结构的电化学SNP检测

单碱基多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）一直以来被认为可以作为疾病诊断的有效标记,所以这方面的研究一直备受关注.现有的检测方法多在均相体系中进行.相比较而言,在界面上如果能方便快捷地区分SNP,此方法在医疗检测方面的应用性就可以大为加强.我们成功地利用DNA自组装技术在金电极表面组装了四面体结构的DNA纳米结构探针（tetrahedron structure probes,TSPs）,有效地控制界面上DNA组装的密度,使得基于四面体结构的DNA探针的杂交行为更接近于溶液相体系,进而实现了在原有界面上受限于异相反应而无法较好完成的SNP分型检测.在TSP和作为信号分子的reporter DNA之间只有6个互补配对碱基的条件下,就可以得到大于10倍的信噪比.相对地,在传统的单链DNA组装上6个碱基的作用力不足以实现良好的信噪比.同时,基于TSP的金电极组装模式由于较厚的四面体组装层所得到的有效空间,更利于DNA杂交反应以及复杂结构的形成.我们使用了Y-支状的DNA杂交策略分别在TSP和单链上做了对比,发现TSP能非常好地区分SNP,而传统单链上在Y-支状DNA杂交策略的条件下区分度就非常有限.这两点都充分地体现了TSP更接近于溶液相体系的优越性,这种三维DNA探针的优越性为我们研究和应用DNA纳米技术在界面反应提供了新的可能.     

电化学DNA生物传感器*

对特异DNA序列的检测在基因相关疾病的诊断、军事反恐和环境监测等方面均具有非常重要的意义,DNA传感器的研究就是为了满足对特异DNA序列的快速、便捷、高灵敏度和高选择性检测的需要。近年来涌现出了多种传感策略,根据检测方法的不同可以大致分为光学传感器、电化学传感器、声学传感器等。由于电化学检测方法本身所具有的灵敏、快速、低成本和低能耗等特点,电化学DNA传感器已成为一个非常活跃的研究领域并在近几年中得到了快速发展。本文概括了近年来在DNA传感器的重要分支——电化学DNA传感器领域内的一些重要进展,主要包括DNA探针在传感界面上的固定方法和各种电化学DNA杂交信号的检测方法。     

DNA甲基化电化学分析

DNA甲基化是目前研究最多的DNA表观遗传修饰之一.大量研究表明,DNA甲基化会引起DNA结构、稳定性以及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而影响基因表达,进而引起多种神经退行性疾病、免疫系统疾病甚至癌症.因此,发展简易、灵敏、准确、可靠的方法进行DNA甲基化的分析是至关重要的.本文简单介绍了DNA甲基化的分析方法,重点综述了DNA甲基化的电化学分析方法,并对DNA甲基化的研究前景进行了展望.     

基于DNA聚合酶I的新型电化学传感器及其胰腺癌K-ras基因点突变检测

本文构建DNA聚合酶I的新型DNA电化学传感器,将捕获探针通过Au-S键固定于Au基底表面,与互补靶序列杂交至点突变前一个碱基,通过DNA聚合酶Ⅰ将dUTP-biotin连接在目标DNA的检测位点,再与avidin-HRP反应,而后测定在TMB溶液中的电化学特性. 结果表明,DNA电化学传感电极的检测电流值与K-ras突变型基因浓度（1.0×10^-15 ~ 1.0×10^-10 mol·L^-1）对数呈良好的线性关系,且灵敏度高,特异性较佳.     

Enhanced Electrochemical Detection of DNA Hybridization Based on Au/MWCNTs Nanocomposites

Abstract

The nanocomposites of gold nanoparticles and multi‐walled carbon nanotubes (MWCNTs) have been applied in the enhanced electrochemical detection of DNA hybridization. Gold nanoparticles coated on MWCNTs uniformly were synthesized by simply one step reaction. Target DNA was detected by the peak current difference of differential pulse voltammetry (DPV) signals of the electroactive indicator methylene blue (MB) before and after hybridization on the Au/MWCNTs modified glass carbon electrode (GCE). Due to the excellent electrical conductivity of the novel matrix, the biosensor revealed high sensitivity with the detection level down to 1.0 pM. Excellently selectivity and reproducibility were also discussed.     

基于富勒烯衍生物修饰玻碳电极的DNA电化学传感器

以富勒烯C₆₀, L-苏氨酸及对苯二甲醛为原料, 在氮气保护下反应得到含醛基官能团的2-(4-醛基苯基)-5-(1-羟乙基)富勒烯吡咯烷衍生物(C₆₀-CHO). 将该材料修饰于玻碳电极表面, 并利用醛基与氨基之间温和、高效的缩合反应, 将5-氨基修饰的寡聚核苷酸共价固定到了C₆₀-CHO修饰的玻碳电极表面, 构建了一种新型的电化学DNA传感器. 以[Fe(CN)₆]^3−/4−为电活性探针, 采用电化学阻抗法对转基因植物CaMV35S启动子基因特征片段进行检测. 实验结果表明, 杂交前后的电子传递电阻差值(DR_et)与目标序列浓度对数(lg C_S2)在1.0×10^－13～1.0×10^－9 mol/L浓度范围内呈良好的线性关系, 线性回归方程为DR_et/(10³ Ω)＝3.471 lg (C_S2/mol/L)＋50.425 (r＝0.9977), 检测限为1.5×10⁻¹⁴ mol/L. 杂交特异性实验进一步表明该传感器对完全互补、碱基错配和非互补序列具有良好的识别能力.     

Fabrication of a Sensitive Electrochemical Biosensor for Detection of DNA Hybridization Based on Gold Nanoparticles/CuO Nanospindles Modified Glassy Carbon Electrode

In this work, a sensitive electrochemical DNA biosensor for the detection of sequence‐specific target DNA was reported. Firstly, CuO nanospindles (CuO NS) were immobilized on the surface of a glassy carbon electrode (GCE). Subsequently, gold nanoparticles (Au NPs) were introduced to the surface of CuO NS by the electrochemical deposition mode. Probe DNA with SH (HS‐DNA) at the 5′‐phosphate end was covalently immobilized on the surface of the Au NPs through Au? S bond. Scanning electron microscopy (SEM) was used to elucidate the morphology of the assembled film, and electrochemical impedance spectroscopy technique (EIS) was used to investigate the DNA sensor assembly process. Hybridization detection of DNA was performed with differential pulse voltammetry (DPV) and the methylene blue (MB) was hybridization indicator. Under the optimal conditions, the decline of reduction peak current of MB (ΔI) was linear with the logarithm of the concentration of complementary DNA from 1.0×10^?13 to 1.0×10^?6 mol·L^?1 with a detection limit of 3.5×10^?14 mol·L^?1 (S/N=3). In addition, this DNA biosensor has good selectivity, and even can distinguish single‐mismatched target DNA.     

寡聚酰胺为探针的电化学DNA生物传感器

DNA分子中的碱基对可以长程传递电荷, DNA分子中的碱基π堆积结构为电荷的长程传递提供了良好的通道. 电荷在DNA分子中的传递受碱基序列的影响, 利用这种性质可以构建DNA碱基错配检测的电化学传感器. 寡聚酰胺能和DNA以小沟绑定方式高亲和力地结合, 并且具有序列识别功能, 本文以带有硝基官能团的寡聚酰胺分子为电化学探针, 设计了电化学DNA生物传感器. 结果显示, 寡聚酰胺与DNA修饰电极作用后, 电化学响应显著增强, 并且可以作为检测DNA碱基错配的电化学探针分子.     

基于纳米MnO2的免标记型DNA电化学生物传感器用于大肠杆菌的测定

以室温固相合成法制备纳米MnO2,通过壳聚糖（CHIT）的成膜效应将纳米MnO2固定在玻碳电极表面。DNA在MnO2/CHIT膜上的固定和杂交通过循环伏安和电化学交流阻抗进行表征。以电化学阻抗免标记法检测目标DNA,固定于电极表面的DNA探针与目标DNA杂交后使电极表面的电子传递电阻增大,以此作为检测信号可以高灵敏度地测定目标DNA。电化学阻抗谱检测大肠杆菌基因片段的线性范围为2.0×10^-11 ～2.0×10^-6mol/L,检出限为1.0×10^-12mol/L。     

Development of a Novel Electrochemical Sensor Based on Gold Nanoparticle-Modified Carbon-Paste Electrode for the Detection of Congo Red Dye

In this study, gold nanoparticles (AuNPs) were electrodeposited on samples of a carbon-paste electrode (CPE) with different thicknesses. The prepared AuNPs were characterized using different analysis techniques, such as FTIR, UV–Vis, SEM, EDX, TEM images, and XRD analysis. The fabricated modified electrode AuNPs/CPE was used for the sensitive detection of Congo red (CR) dye. Electrochemical sensing was conducted using square-wave voltammetry (SWV) in a 0.1 M acetate buffer solution at pH 6.5. The proposed sensor exhibited high efficiency for the electrochemical determination of CR dye with high selectivity and sensitivity and a low detection limit of 0.07 μM in the concentration range of 1–30 μM and 0.7 μM in the concentration range of 50–200 μM. The practical application of the AuNPs/CPE was verified by detecting CR dye in various real samples involving jelly, candy, wastewater, and tap water. The calculated recoveries (88–106%) were within the acceptable range.     

Electrochemical Resistive DNA Biosensor for the Detection of HPV Type 16

In this work, a low-cost and rapid electrochemical resistive DNA biosensor based on the current relaxation method is described. A DNA probe, complementary to the specific human papillomavirus type 16 (HPV-16) sequence, was immobilized onto a screen-printed gold electrode. DNA hybridization was detected by applying a potential step of 30 mV to the system, composed of an external capacitor and the modified electrode DNA/gold, for 750 µs and then relaxed back to the OCP, at which point the voltage and current discharging curves are registered for 25 ms. From the discharging curves, the potential and current relaxation were evaluated, and by using Ohm’s law, the charge transfer resistance through the DNA-modified electrode was calculated. The presence of a complementary sequence was detected by the change in resistance when the ssDNA is transformed in dsDNA due to the hybridization event. The target DNA concentration was detected in the range of 5 to 20 nM. The results showed a good fit to the regression equation ΔRtotal(Ω)=2.99 × [DNA]+81.55, and a detection limit of 2.39 nM was obtained. As the sensing approach uses a direct current, the electronic architecture of the biosensor is simple and allows for the separation of faradic and nonfaradaic contributions. The simple electrochemical resistive biosensor reported here is a good candidate for the point-of-care diagnosis of HPV at a low cost and in a short detection time.