基于CRISPR/Cas9技术建立敲除Plac9基因的人胚肾细胞株

目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo2000将表达载体分别转染至293T细胞中,并以流式细胞术对带绿色荧光蛋白标记的细胞进行单细胞分选,分选后的细胞培养一段时间后,用基因组测序和错配酶酶切进行筛选.从筛选好的细胞中提取蛋白,进行Western Blot检测敲除效率.结果:采用CRISPR/Cas9和流式细胞术结合技术成功构建了Plac9蛋白表达缺失的人胚肾细胞株.结论:该方法简便快捷、效率高,可广泛地用于编辑各种细胞和细胞功能研究.     

靶向小鼠CREPT基因CRISPR/Cas9敲除质粒的构建

目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建靶向小鼠CREPT基因的敲除质粒。方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则靶向小鼠CREPT基因的sgRNAs,与体外转录载体pUC57-sgRNA连接,构建CREPT基因敲除质粒;体外切割实验验证设计的sgRNAs是否具有活性。结果 设计了3条sgRNAs并分别准确插入pUC57-sgRNA载体;体外切割实验结果显示,以上3条sgRNAs均能够介导Cas9蛋白对靶片断进行切割。结论 制备了小鼠CREPT基因敲除质粒和体外转录的sgRNAs,为构建CREPT基因敲除小鼠模型奠定了重要基础。     

利用CRISPR/Cas9系统建立成体心肌细胞特异性Oga基因敲除小鼠模型

目的 利用腺相关病毒9(AAV9)介导的CRISPR/Cas9系统构建成体心肌细胞特异性Oga基因敲除小鼠模型,来研究内源性OGA在成体心脏稳态维持中的功能。方法 首先,筛选靶向Oga编码区的有效sgRNA,构建包装表达有效sgRNA的AAV9病毒。其次,建立心肌细胞特异性SpCas9表达小鼠(α-MHC^Cas9),并通过腹腔注射方式将AAV9-sgOga注射到小鼠体内。通过qPCR和Western blot印记杂交实验检测Oga的表达情况,确定Oga敲除是否成功。最后,通过组织学分析心脏结构,以及超声心动图分析心脏功能,来分析Oga对心脏稳态维持的影响。结果 筛选到2条可以有效靶向Oga编码区的sgRNA,通过AAV9递送实现了Oga基因在心脏组织的有效敲除,且导致O-GlcNAcylation表达显著上升;组织学分析和超声心动图分析发现基因敲除小鼠心脏结构及功能在基础水平与对照小鼠无显著变化。结论 利用AAV9介导的CRISPR/Cas9系统成功建立了成体心肌细胞Oga基因敲除的小鼠模型,为研究OGA介导的O-GlcNAcylation清除在心脏稳态维持中的功...     

利用CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除人源HOIP基因

泛素化修饰是一种能调节诸多细胞功能的重要蛋白质翻译后修饰,近几年研究发现了一种新的泛素化修饰即线性泛素化修饰,LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)是目前已知唯一的导致蛋白质发生线性泛素化修饰的E3酶。目前LUBAC复合物的底物和功能所知甚少。为了探索LUBAC复合物新的底物和功能,利用CRISPR/Cas9慢病毒系统构建稳定敲除LUBAC核心组分HOIP基因的HeLa细胞系,通过质谱鉴定此细胞系和对照细胞的差异泛素化修饰蛋白质,即可能是LUBAC新的底物。首先将靶向HOIP基因的不同CRISPR序列插入lenti CRISPRv2载体中,制备慢病毒质粒感染He La细胞,然后使用嘌呤霉素压力筛选,用Western Blot方法检测HOIP基因的敲除效果,最后成功地构建HOIP基因稳定敲除HeLa细胞系。此稳定细胞系的构建为日后深入研究LUBAC的功能提供一个人类细胞模型。     

基于CRISPR/Cas9的毛果杨bHLH106转录因子的功能研究

目的 采用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制毛果杨(Populus trichocarpa)bHLH106(Basic Helix-Loop-Helix 106)基因的突变体,分析植株的表型特征,初步揭示PtrbHLH106基因在毛果杨木材形成过程中的功能。方法 基于前期对毛果杨野生型(WT)茎干的不同细胞类型(形成层、木质部和韧皮部细胞)RNA-seq数据,克隆得到一个在形成层及木质部较高表达的bHLH基因PtrbHLH106。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制毛果杨PtrbHLH106的功能缺失突变体。对生长60、90、120 d的毛果杨ptrbhlh106突变体和WT植株进行表型观察;对生长120 d的植株各茎节进行石蜡切片,利用甲苯胺蓝染色观察并进行细胞统计分析。结果 获得毛果杨ptrbhlh106突变体;与WT相比,突变体植株的株高、地径无明显差异;在整个测量的生长周期中,第8茎节长度有缩短的趋势,茎节数量有增加的趋势;形成层细胞层数有增加的趋势但差异不显著,导管细胞孔径显著增大,纤维细胞数量显著减少。结论 ptrbhlh106突变体与WT植株在导管孔径和纤维细胞数量上存在差异,初步证明PtrbHLH106基因参与了调控毛果杨次生木质部的发育。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了...     

基于CRISPR/Cas9的毛果杨PtrHBI1基因功能解析

目的 利用CRISPR/Cas9系统创制毛果杨PtrHBI1功能缺失突变体,初步解析该转录因子在木材形成过程中的功能,为利用基因工程手段培育制浆造纸优良性状的林木新品种提供新思路。方法 以毛果杨(Populus trichocarpa)为研究材料,根据激光显微切割技术捕获的野生型毛果杨不同细胞类型(形成层、木质部和韧皮部)RNA-seq数据,筛选得到1个bHLH家族转录因子PtrHBI1,利用毛果杨木质部原生质体系统对该基因进行亚细胞定位分析,采用原位杂交技术分析PtrHBI1组织特异性表达,采用CRISPR/Cas9技术创制毛果杨ptrhbi1突变体。对ptrhbi1突变体进行生长表型分析,利用石蜡切片对茎段横切面的各细胞类型进行形态分析,利用Klason酸水解法检测突变体木质素含量,使用高效液相色谱测定突变体纤维素和半纤维素含量。结果 亚细胞定位显示PtrHBI1基因定位于细胞核,原位杂交结果表明PtrHBI1主要在形成层和木质部表达。通过CRISPR/Cas9创制的毛果杨ptrhbi1突变体株高显著增加,茎节数和地径在一定时期显著大于野生型。此外,突变体的导管孔径显著增大,纤维细胞数量显著减少。导管细胞的数量和形成层细胞层数与野生型无差异。木材组分分析表明,与野生型植株相比,ptrhbi1植株的纤维素含量增加,木质素总量无显著变化,紫丁香基木质素与愈创木基木质素之质量比(S/G)显著降低。结论 PtrHBI1参与调控毛果杨的生长及次生木质部发育,可能在木材形成过程起着较为重要的调控作用。     

基于CRISPR/Cas9系统制备猪Pax2基因敲除细胞系

肾脏发育缺陷或缺失的猪模型可为人源化肾脏器官在异种动物体内再生提供“发育空位”,因此敲除肾脏发育关键基因Pax2(Paired box2)获得该动物模型是肾脏再生的关键步骤。本文利用生物信息学分析软件比对分析了不同物种间Pax2蛋白结构,明确了猪Pax2蛋白在氨基酸序列、二级结构和三级结构方面与人、小鼠具有相似性。结合Pax2蛋白在人和小鼠肾脏发育中的功能,选择猪Pax2基因第8外显子序列作为打靶目标区间,设计并构建了用于敲除猪Pax2基因的CRISPR/Cas9打靶载体。在检测CRISPR/Cas9载体打靶猪Pax2基因效率的基础上,利用细胞核转染和G418药物筛选获得巴马小型猪细胞单克隆。通过PCR、T载体克隆和Sanger测序检测各细胞单克隆Pax2基因的敲除情况,鉴定出33个双等位基因敲除Pax2基因的巴马小型猪细胞系,敲除效率达到45.21%(33/73)。本研究为肾脏缺失或肾发育不全的猪模型的获得奠定实验基础,同时为后续在猪体内再造人源化肾脏以及肾发育疾病的研究提供了研究材料。     

基于CRISPR/Cas9系统构建Slfn2基因敲除的小鼠肺癌细胞系

为构建Slfn2^-/-小鼠肺癌细胞系(Lewis lung carcinoma, LLC),本文利用CRISPR/Cas9技术,在CHOPCHOP网站筛选Slfn2基因的sgRNA序列,将合成的oligo序列退火后连接至pLenti CRISPR v2质粒中,并与pMD2.G、psPAX2共转染至293T细胞中包装慢病毒;利用包装的慢病毒感染LLC细胞,经筛选和单克隆培养,获取Slfn2^-/-敲除的LLC细胞。结果显示：SgRNA成功插入载体重组质粒;利用3质粒包装的慢病毒成功将LLC中的Slfn2基因突变,获得丢失8个碱基移码突变和丢失180个碱基缺失突变的Slfn2^-/-小鼠肺癌细胞。可见,利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Slfn2基因敲除的小鼠肺癌细胞。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻植酸合成酶IPK1基因

低植酸是作物育种目标之一,然而植酸对植物自身的影响至今未有科学评估.为此,在建立粳型常规水稻"金粳818"再生体系基础上,利用农杆菌介导的遗传转化方法将针对植酸合成最后一步磷酸化反应的1, 3,4, 5, 6-五磷酸肌醇2-激酶基因IPK1构建的3个CRISPR/Cas9载体分别转入"金粳818".分子检测发现,再生的42株植株中,40株为转化株,显示转化率高达95%.靶点序列分析发现,26株绿色转化株中,1株基因组发生了编辑.编辑株靶点测序发现,除碱基缺失外,附近序列错配达30%.这些结果为水稻低植酸种质的创制及植酸的功能分析奠定了技术基础.同时,本文对水稻再生株的白化现象进行了探讨.     

一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法

利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6启动子上的LKO1.5引物对每个菌落序列进行了测序验证,结果表明利用此新方法可以成功构建CRISPR/Cas9系统的Knock Out载体.     

基于 CRISPR / Cas9 技术构建点突变小鼠概述

摘要:2013 年 CRISPR( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas( CRISPR-associated) 系统证实能够对人的细胞和其他真核细胞进行基因组编辑,现已广泛应用于生物医学领域。 本文对 CRISPR 在点突变小鼠构建中的应 用 进 行 概 述,为 单 向 导 RNA ( single guide RNA, sgRNA) 和 修 复 模 板 单 链 寡 聚 核 苷 酸 ( single-strand oligonucleotide,ssODN)的设计及体外转录、受精卵显微注射、子代鼠的鉴定等提供理论参考。     

Cationic polymeric nanoformulation: Recent advances in material design for CRISPR/Cas9 gene therapy

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/clustered regularly interspaced short palindromic repeat associated proteins 9) gene editing platform is a promising therapeutic tool for genetic disorders, due to its ability to manipulate the pathogenic gene in genomic level and to easily target specific gene by manipulating single-guide RNA. However, its successful delivery remains a challenge. Up to now, great efforts have been made to explore an effective strategy for CRISPR/Cas9 delivery. But among those delivery methods, physical methods are mainly operated on cultured cells thus limited to laboratorial use; viral vectors are hindered by fetal immunogenic and carcinogenic effects thus dubious in clinical application. Therefore, cationic polymeric vectors, with the ability to interact with CRISPR/Cas9 system to form a nanoformulation as a non-viral approach, are attracting increasing attentions, due to advantages such as well protection of cargos, less limitation in payload size, low immunogenicity or carcinogenicity, potential modifications for further functions, and ease in mass production. In this review, the recent discoveries on polymeric vectors utilized in delivery of CRISPR/Cas9 system will be summarized. With emphasis on advanced features of those polymeric vectors or their nanoformulations to meet the demands of different CRISPR/Cas9 delivery forms (plasmid, mRNA or protein), the detailed illustrations on their disease treatment applications, such as cancer, diabetes or antibiotic-resistant infections, will also be reviewed.     

CRISPR/Cas技术在木本植物改良中的应用

木本植物育种周期长、种质资源匮乏,已成为限制木本植物种质创新的主要因素。CRISPR/Cas系统是近年来发展起来的能够实现对基因组进行精准定点编辑的技术,具有操作简单、周期短、效率高等优点,可实现基因的敲除、插入、替换等目的,从而精确地引入目标性状。目前,该技术已在多种家畜、昆虫、作物中得到了成功应用,对大量性状进行了改良,实现了种质资源的原始创新,大大缩短了育种年限。CRISPR/Cas技术的产生为木本植物的遗传改良提供了契机。笔者对CRISPR/Cas技术在杨树(Populus spp.)、苹果(Malus spp.)、柑橘(Citrus spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、木薯(Cassava spp.)等木本植物育种中的应用进行了总结,该技术实现了T0代木本植物优良基因型的固定,在生长、材性、抗病性、抗旱性等性状上得到了明显改善,加快了木本植物育种进程,提高了育种效率。但该技术在木本植物中的应用尚处于起步阶段,还存在脱靶率高、编辑效率低、纯合突变少等问题。基于此,对CRISPR/Cas技术在木本植物中的应用前景进行了展望,以期为木本植物基因功能研究及品种改良提供有益参考。     

Cpf1 和 Cas9核酸酶靶向EGFR-L858R突变的研究

表皮生长因子受体(EGFR)单核苷酸突变(2573TG,L858R)占所有EGFR突变的90%.使突变的EGFR失活对有此突变的病人非常有利.这里,应用双荧光报告分析的方法分析规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)系统中Cpf1和Cas9在靶向EGFR-L858R突变的编辑效率.在EGFR-L858R突变位点的附近,有两个Cpf1前间区序列邻近基序(PAMs)——TTTN.并且,2573TG突变形成了一个Cas9的PAM——NGG.因此本文通过构建两条AsCpf1的gRNAs(gRNA1和gRNA2)和一条SpCas9的gRNA(gRNA3)在体外通过双荧光蛋白分析系统去评估SpCas9和AsCpf1特异性靶向等位基因的能力.结果证实了AsCpf1和SpCas9都能够特异性的编辑突变的EGFR(2573TG).     

基于CRISPR/Cpf1系统下的诱导型多基因激活体系的建立

为开发高效率的内源多基因激活工具,利用CRISPR/Cpf1系统能够促使pre-crRNA中多个crRNA自我剪切和释放的特性,将As/Fn/LbCpf1的核酸酶区域定点突变形成dCpf1,并在C端和N端分别引入了VPR三元转录激活域和不稳定结构域(DD-domain)、四环素控制的操纵子,构建了TRE3G-DD-dCpf1-VPR激活系统。结果显示,Oct4基因的转录水平提升高达10~4倍,且Myod1、Oct4基因的转录水平分别在Dox和TMP单药的控制下,能够实现不同程度的转录水平的提升,在加双药的条件下Myod1、Oct4基因可分别提高80、120多倍。证明该系统能够通过靶向DNA快捷、高效的进行诱导内源性多基因激活。     

新型基因编辑技术CRISPR/Cas9系统研究现状

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌防御外来噬菌体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统.依据Cas蛋白种类和同源性,CRISPR/Cas系统被分为3类,其中,Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白参与,而Ⅱ类系统,即CRISPR/Cas9组成简单,仅需Cas9蛋白参与即可.经过遗传工程改造后的CRISPR/Cas9已经作为一种新型的基因编辑工具被用于多种生物的基因组编辑.本文就CRISPR/Cas9系统的发现、结构组成、作用机制、研究现状、面临的困境及应用前景等几方面进行了总结.