小型猪生长激素基因研究进展

小型猪(Miniature pig)由于其体型小、饲料消耗少、便于操作、世代间隔短、具有大家畜和实验动物的双重特点,因此是一种理想的实验动物模型。目前主要应用于医学中的新药开发与鉴定、胚胎工程技术、心血管模型建立等研究领域[1]。猪生长激素(Porcine growth hormone,PGH)是由猪     

广西巴马小型猪生长激素(pGH)基因全序列克隆及序列分析

目的克隆广西巴马小型猪生长激素(pGH)基因全序列,并与已发表的其它品种猪的生长激素(pGH)基因全序列进行比较,探讨该基因在广西巴马小型猪中可能存在的变异。方法以广西大学巴马小型猪基因组DNA为模板,扩增巴马小型猪生长激素基因的全序列,将该扩增片段亚克隆到pMD18-T载体后测序。再将测序结果在NCBI进行BLAST。结果测序结果证明克隆得到了巴马小型猪GH基因,全长为2 007 bp。同源性比较发现,巴马小型猪GH基因全序列与GenBank中发表的五指山猪、太湖猪及普通猪的GH基因全序列的同源性分别为99.4%、98.3%、93.9%。     

广西巴马小型猪促生长激素释放激素成熟肽的克隆及序列分析

目的扩增广西巴马小型猪促生长激素释放激素(GHRH),分析其序列结构特点。方法以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,用特异性引物扩增GHRH外显子3,再用引物延伸悬挂PCR法扩增GHRH成熟肽,纯化后,连接、转化到大肠杆菌,筛选阳性克隆,测序。结果经测序证实广西巴马小型猪GHRH外显子3及其成熟肽的基因序列与相关文献报道一致。克隆得到的广西巴马小型猪GHRH序列全长为132 bp,其中外显子3基因序列长105bp。同源性比较发现,广西巴马小型猪GHRH外显子3基因序列与GenBank(NCBI)中报到的猪GHRH外显子3相比,同源性为97.14%,有3处发生碱基变化。结论本实验成功克隆了广西巴马小型猪GHRH成熟肽序列。     

大肠杆菌中重组猪生长激素提取方法及变复性的比较研究

通过对基因工程菌pgh／E．coli BL21用酶溶解、超声波处理、超声波处理与液氮冻融相结合三种方法进行破菌，用盐酸胍法进行变复性，提取重组猪生长激素(rpGH)．结果表明用超声波处理与液氮冻融相结合的方法裂解细菌，盐酸胍法变复性，rpGH的提取率最高，达72．16％；而用尿素法对rpGH在大肠杆菌内所形成的包涵体变复性，rpGH的提取率仅为49．82％．     

亚洲黑熊活化素βA亚基基因克隆及分子进化分析

借鉴互联网中已克隆的活化素βA亚基基因的序列.设计并合成一对兼并引物,首次扩增和克隆到亚洲黑熊βA亚基基因的357 bp片段,以水作为阴性对照排除污染,多次重复实验获得一致稳定结果.序列分析显示此片段在处于不同进化程度的物种之间,仍然具有高度的保守性,亚洲黑熊βA亚基基因与人相比有29个核苷酸差异,一致性高达91.6%;与亲缘关系较近的大熊猫、小熊猫和马来熊相比,分别有4、20、3个核苷酸差异,一致性分别为98.9%、94.4%、99.2%.系统发育分析和酶切图谱分析显示亚洲黑熊、大熊猫和马来熊具有较近的亲缘关系,而它们与小熊猫的亲缘关系较远.     

t-PA cDNA基因的克隆及测序

从基因工程菌株里氏木霉中提取基因组DNA,根据t-PAcDNA序列设计一对引物,利用PCR法扩增目的基因,将其与pMD18-T-Vector连接后转入大肠杆菌,通过Amp抗性和蓝白斑筛选出重组菌株,PCR法和双酶切法鉴定后再进行测序鉴定,测序结果表明:克隆的t-PAcDNA的第34位、450位和521位基因发生了突变。     

广西巴马小型猪生长素(Ghrelin)cDNA的克隆及序列分析

目的扩增广西巴马小型猪生长素(Ghrelin)cDNA序列,分析其序列结构特点,为进一步从分子水平上对广西巴马小型猪的生长发育提供理论依据,也为日后构建原核表达载体、研究Ghrelin基因的生物功能奠定基础。方法以广西巴马小型猪胃底组织总RNA为模板,用特异性引物扩增Ghrelin的cDNA,纯化连接pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆体,鉴定后测序。结果经测序证实克隆得到的广西巴马小型猪Ghrelin cDNA序列全长为357 bp,与相关文献报道一致。同源性比较发现,广西巴马小型猪Ghrelin cDNA基因序列与GenBank报道的猪相应序列同源性为99.7%,只有一处发生碱基突变。结论本实验成功克隆了广西巴马小型猪Ghrelin cDNA。     

三个品系小型猪Ⅱ型糖尿病模型的比较研究

目的比较三个品系小型猪对高糖高脂饲料诱发Ⅱ型糖尿病模型的敏感性,为我国小型猪在Ⅱ型糖尿病研究中的应用提供基础资料。方法4~5月龄巴马小型猪、五指山小型猪和中国农大小型猪各6头,以4头中国农大小型猪为对照,同步开展高糖高脂饲料喂养试验,试验周期8个月。每月称1次体重,测定血糖、血清胰岛素含量,每2个月进行1次静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT),测定脂质代谢相关指标。结果巴马小型猪和五指山小型猪对高糖、高脂饲料比较敏感,在饲喂5~6个月后,开始出现糖代谢异常,表现为显著肥胖、血清胰岛素升高和胰岛素敏感性下降。至实验后8个月,巴马小型猪和五指山小型猪各有1头发展为糖尿病,分别有3头和2头出现糖尿病前期症状。中国农大小型猪对高糖高脂饲料诱发糖尿病相对不敏感,实验期间空腹血糖水平、血清胰岛素含量、胰岛素敏感指数和IVGTT一直无显著变化,仅在实验后7个月开始表现肥胖,8个月出现胰岛素敏感性减低。三个品系小型猪在高糖高脂饲喂后,血脂相关指标(TG,CHO,HDL-C,LDL-C)普遍升高,以巴马小型猪升高幅度最大。结论巴马小型猪和五指山小型猪对高糖、高脂饲料诱发Ⅱ型糖尿病比较敏感,品系内个体差异较大。中国农大小型猪相对不敏感。这一结果为进一步的Ⅱ型糖尿病相关基因分析和高敏感家系培育研究提供了基础资料。     

猪黑皮质素受体3和4基因克隆及分析

以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆长白猪黑皮质素受体3和4基因(MC3R和MC4R).序列分析显示:长白猪MC3R基因cDNA编码具319个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠和斑马鱼的氨基酸序列一致性分别为86.4%、83.3%、82%和69.7%;MC4R基因cDNA全长1175bp,编码具332个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠的氨基酸序列一致性高达94%以上,与斑马鱼MC4R氨基酸序列享有70.7%的同源性.序列分析显示,猪MC3R和MC4R基因都具有典型的七次跨膜结构域,和短的胞内环和胞外环,且在第五个跨膜域中保守的甲硫氨酸(M)分别替换为异亮氨酸(I)和缬氨酸(V).另外,在猪MC3R和MC4R中还鉴定到保守的半胱氨酸残基,第一个胞内环中保守的PMY基序和N末端的3个N-链接糖基化位点.组织表达图谱分析表明,MC3R主要在大脑和脾中高表达,而MC4R主要在六种检测的组织中都有表达,在肾中表达较弱.     

广西巴马小型猪卵泡抑素(Follistatin)克隆及原核表达

目的通过RT-PCR扩增获得广西巴马小型猪Follistatin的cDNA全序列,经克隆测序分析其cDNA序列结构,进而构建pET-Fo原核表达质粒,使用IPTG诱导表达获得其融合蛋白,为将来进一步研究Follistatin对广西巴马小型猪肌肉生长和繁殖性能的影响奠定基础。方法从广西大学巴马小型猪卵巢中提取总RNA,并以其为模板,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),在合成的特异性引物引导下,扩增获得广西巴马小型猪卵泡抑素(Follistatin)cDNA的全序列,长度为1 035 bp。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析。结果广西巴马小型猪卵泡抑素cDNA序列与GenBank中已报道的家猪卵泡抑素同源性高达99.4%。同时,将目的基因插入到原核表达载体pET 32a 多克隆位点中,构建了Follistatin的原核表达载体,并转化于大肠杆菌BL21。转化菌经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。结论实验已成功地表达了Follistatin的融合蛋白(约58.4 ku)。     

五指山猪生长激素基因全序列克隆及序列分析

通过筛选一对引物，PCR扩增五指山小型猪GH基因全序列，并进行克隆测序分析、序列分析及氨基酸分析．结果表明，有98个位点不同，同源性为95．026％，外显子有2个碱基发生了突变，其中外显子2有1个位点的碱基突变导致了氨基酸异义取代。     

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)几丁质酶基因克隆的筛选及序列分析

用改进方法提取粘质沙雷氏菌染色体DNA.通过PCR扩增,得到几丁质酶(chiA)基因,利用pUC19质粒构建了含有chiA基因的克隆载体 ,并转化E.coli DH5α.经测序分析,证明克隆片段与文献报道基本相同,仅在第437位碱基由C变为T.     

南方鲇GK基因片段的克隆及序列分析

为从南方鲇(Silurus meridionalis)中扩增葡萄糖激酶(GK)基因,根据已报道的GK基因结构中的氨基酸保守区域,设计简并引物;从南方鲇肝胰脏中迅速抽提RNA,将扩增出的产物克隆到pMD18-T载体上并导入到大肠杆菌DH5α中;阳性克隆鉴定后测序.将测序得到的南方鲇GK基因与已知的GK基因进行核苷酸序列比...     

产气荚膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析

利用PCR技术，从C型产气荚膜梭茵中国标准株C59-44基因组DNA中扩增出了约0．7kb的基因，并将其克隆到pGEM-T栽体上，经酶切鉴定及核苷酸序列分析表明，该基因片段的核苷酸序列与国外报道的β2毒素基因序列一致．     

多鳍鱼Shh基因克隆与同源性分析

根据已报道的软骨鱼、硬骨鱼、两栖类、鸟类、哺乳类和人的Sonichedgehog(Shh)基因序列,在Shh基因保守区设计一对简并性引物,利用PCR技术从多鳍鱼cDNA中扩增Shh基因。结果显示,多鳍鱼Shh基因全长1263bp,编码421个氨基酸。通过同源性比较发现,多鳍鱼与肺鱼的同源性最高,为82.5%,二级结构分析表明,Shh蛋白含有30.71%的α螺旋,21.67%的扩展线条和47.62%的无规卷曲,不含β片层;并以蛋白质结构数据库(PDB)中已解析的Shh蛋白的三维结晶结构(3D)为模板,利用http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html同源模建Shh蛋白的三维结构,为进一步研究Shh基因在胚胎体节发育和肢芽图式形成中的功能奠定了基础。     

猪生长激素受体(GHR)基因启动子的 克隆及功能分析

本研究以猪作为研究模型, 对GHR基因启动子区开展了克隆 、转录因子结合位点分析和启动子活性鉴定.结果表明: 家猪GHR基因或由两个启动子(GHR P1和GHR P2)控制.GHR P1的部分核苷酸序列与牛、羊对应核苷酸序列具有较高的同源性, 但功能分析显示其启动子活性较低.针对GHR P2的实验结果表明其具有典型的GHR组成型启动子特征, 荧光素酶报告实验表明其具有启动子活性, 因此我们推测本次克隆获得的GHR P2是猪GHR的组成型启动子.     

赤红球菌JDM312株环己酮单加氧酶基因的克隆和序列分析

应用PCR从赤红球菌JDM312株基因组DNA中扩增出chnB基因序列,构建pUC18-chnB重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,并对插入片段进行测序,用Clustal X和Mega 3.1软件对测定DNA序列进行相似性和系统发育分析.结果显示：扩增得到的chnB基因大小为1 623 bp,编码由542个氨基酸残基构成的...     

小拟南芥几丁质酶基因cDNA的克隆与序列分析

通过合成1对特异引物，应用RT-PCR技术从小拟南芥总RNA中经反转录克隆出几丁质酶基因，该cDNA基因全长985bp，含有1个963bp的开放阅读框(ORF)，编码321个氨基酸，推测分子量为35．53kD，序列同源性分析表明，该基因与拟南芥几丁质酶基因有93％的同源性。