碱性果胶裂解酶基因pelA在E.coli中的表达和酶学性质研究

根据核苷酸序列分析结果设计引物,通过PCR的方法,在嗜碱芽孢杆菌NTT33的总DNA和p1350中分别扩增到预计大小的片段,证明p1350中的外源DNA片段来自于嗜碱芽孢杆菌NTT33.同时也获得了含有pelA完整ORF的DNA片段.经计算,该基因表达的成熟蛋白质的分子量为34.76×103.构建表达载体pBV220-pel,在E.coliDH5a中进行表达.SDS-PAGE检测发现,表达的蛋白质分子的大小约为35×103,与预测的相符.初步研究其酶学性质发现,该酶在pH9.0～pH10.0,45℃的条件下有较高的活性,而且必需Ca2+参与反应.     

蚯蚓纤溶酶基因的cDNA克隆及其序列分析

从粉正蚓成体中提取总RNA，以寡核苷酸Oligo(dT)2v为引物合成cDNA第一条链；用RT-PCR的方法扩增蚯蚓纤溶酶的cDNA，将其克隆到pUCm-T载体上进行DNA序列测定．结果表明，所克隆的蚯蚓纤溶酶cDNA长度为747bp，其中编码区段为738bp．共编码246个氨基酸．将该序列与GenBank中其它的4种蚯蚓纤溶酶序列(Lumbricus rubellus EFE-III-1、Lumbricus rubellus lumbrokinase-3(1)precursor、Lumbricus bimastus lumbrokinase、Lumbricus rubellus lumbrokinase-1 T4 precursor)相比．同源性分别为99％，97％，89％，88％；与同源性最高的序列相比，本序列有7个碱基、3个氨基酸与该序列不同．     

钝顶螺旋藻Fe-SOD基因的克隆及序列分析

参照GenBank中Fe-SOD基因序列,根据SOD的保守区域设计引物,以钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)基因组DNA为模板,PCR扩增获得大小为528 bp的片段.序列分析表明,其与集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803)、念珠藻(Nostoc commune DRH1)等物种的Fe-SOD基因的同源性分别为75%、71%,且由该序列推导的氨基酸序列与集胞藻、念珠藻等种属的Fe-SOD相比,同源性为68%、67%.表明该片段为钝顶螺旋藻Fe-SOD基因的部分序列.     

抑癌基因FHIT的克隆和序列分析

用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法,从人脑ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库中克隆 Ｆ Ｈ Ｉ Ｔ 基因扩增得到５５３ ｂｐ 片段克隆于ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｔ 载体,测定了其 Ｄ Ｎ Ａ 序列该序列包括 Ｆ Ｈ Ｉ Ｔ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 编码区全部４４４ ｂｐ,以及５′端５２ ｂｐ 和３′端５７ ｂｐ 非编码区序列编码区有二处位点发生突变：第９２位密码子中的 Ｃ突变成 Ｇ,是同义突变,不导致氨基酸改变;第１１２位密码子中的 Ｃ也突变成 Ｇ,导致由 Ｔｈｒ变为 Ｓｅｒ到目前为止尚未发现有 Ｆ Ｈ Ｉ Ｔ 基因编码区内部点突变导致氨基酸改变的报导     

嗜碱细菌NTT33碱性β-甘露聚糖酶的纯化与性质研究

报道了嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ３３产生的碱性β－甘露聚糖酶经纯化后，在ＰＡＧＥ电泳上呈现一条蛋白带，分子量为３．８９×１０７，等电点为３．０～４．０，酶反应最适ｐＨ为９．０～１０．０，最适作用温度为８０℃，稳定ｐＨ为６．０～９．０，稳定温度为６０℃以下．金属离子Ｃｕ２＋，Ｂａ２＋，Ｍｇ２＋，Ａｌ３＋，Ｃｏ２＋对该酶有一定的激活作用，而Ａｇ＋，Ｈｇ２＋，Ｍｎ２＋对该酶有明显抑制作用，经薄层层析鉴定，该酶水解槐豆胶后产生葡萄糖、甘露糖以及低聚糖．     

嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的克隆及其表达

报导了以启动子探测质粒pKK232-8为载体克隆嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的研究.用限制性内切酶Hindl分别消化嗜碱芽孢杆菌NTT89染色体DNA和质粒pKK232-8,在体外重组,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,在含氨苄青霉素和氯霉素的选择性平板上筛选转化子,结果从NTT89染色体DNA中克隆到一系列带有启动子活性的DNA片段,并在大肠杆菌中得到表达,这些转化子抗氯霉素水平在34～500mg/L不等,随机挑选10个转化子,提取其重组质粒进行限制性酶切,表明转化子中的重组质粒外源片段插入的效率很高,插入片段大小在500～5500bp之间,通过地高辛标记的点杂交和Southern杂交均证明重组质粒上插入的具启动子功能的DNA片段来自于嗜碱芽孢杆菌的染色体DNA.     

耐碱细菌NTT36耐碱基因的克隆及表达产物的分析

耐碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６总ＤＮＡ经ＥｃｏＲＩ酶不完全消化，与质粒ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ酶切产物在体外重组后，转化大肠杆菌ＨＢ１０１．在碱性平板上直接筛选耐碱转化子，转化子经检测具有氨苄青霉素（Ａｍｐｒ）抗性，分析表明转化子具有１５ｋｂ大小的重组质粒．用此重组质粒转化大肠杆菌ＨＢ１０１、ＤＨ５α和ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，均产生大量同时具有耐碱性和Ａｍｐ抗性的转化子．通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和点杂交证明此重组质粒（定名为ｐＧＣＡ）由ｐＵＣ１８和ＮＴＴ３６总ＤＮＡ的片段组成．分别提取上述３种克隆转化子和ＮＴＴ３６细胞膜蛋白，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ梯度凝胶电泳，发现在ｐＨ１０．６条件下培养的转化子和供体菌ＮＴＴ３６与在中性培养基中生长的转化子和受体菌相比，有５条多肽带有明显差异．表明这５条多肽带与耐碱性有关．     

甜瓜抗病基因同源序列的克隆与分析

为了获得新的甜瓜抗病基因同源基因(RGA),我们根据NBS-LRR类抗病基因保守区设计兼并引物组合,以抗病甜瓜品种基因组DNA为模板进行PCR扩增,经筛选、分类与基因测序,获得7个甜瓜RGA序列,其中821与324两个RGA为本研究首次发现.将得到的序列与已知甜瓜RGA序列进行分析、比对,将重复的RGA合并,通过对不同RGA序列同源分析,发现甜瓜CC-NBS-LRR类与TIR-NBS-LRR类RGA的不同分布特征与不同RGA之间的相互关系,如MRGA10与MRGH5可能起源于同一基因.通过对RGA的遗传分析与比较基因组学分析,发现甜瓜RGA序列与抗病基因之间的对应关系,如抗枯萎病基因Fom-1和抗番木瓜环斑病基因Pry存在于nbs47-3(MRGH11)与MRGH21之间,其中候选抗病基因MRGH8推测为Fom-1;候选抗病基因MRGH9、MRGH10之一为Prv.     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX的克隆与表达分析

根据NCBI基因数据库提供的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)基因序列设计简并引物,以青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片cDNA和DNA为材料进行PCR扩增,基因定名为BoAPX(Gen-Bank登录号:HQ871864).BoAPX的基因组全长为1 394bp,具7个内含子,编码区全长为753bp,编码250个氨基酸残基.序列分析结果表明,BoAPX的N端中没有信号肽序列,为胞质型APX,BoAPX与已知APX具有较高的同源性.RT-PCR结果表明,BoAPX的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)诱导,在96h时达最大值,说明BoAPX与霜霉菌抗性相关.以pBI121为植物表达载体,BoAPX为目的基因,成功构建了重组表达载体pBI121-BoAPX.     

嗜盐嗜碱芽孢杆菌NTT76启动子和信号肽序列的克隆及表达

利用启动子信号肽探测型质粒pGPB14,从嗜盐碱芽孢杆菌NTT76的总基因组中克隆具有启动子和信号肽功能的NDA片段,共得到41个转化子,其氨苄青霉素抗性水平在1000－12000mg/L之间,从3个不同抗性不平的转化子中提取重组质粒,酶切显示,外源插入片段在100－500bp之间,将重组粒质转化枯草芽孢杆菌,也同样使枯草芽孢杆菌具有分泌β－丙酰胺酶的功能,β－丙酰胺酶活力测定表明,大肠杆菌产生的酶主要积累在周质空间,而枯草芽孢杆菌产生的酶主要分泌在胞外,对外源插入片段进行定列测定发现,所有片段均含有启动子区、核糖体结合位点和信号肽编码区域。     

人nov基因全长cDNA克隆、测序及其组织表达谱分析

采用特异性mRNA富集技术，从人早期胚胎中得到人nov基因(novH)的cDNA克隆，序列分析表明，该基因cDNA序列由2389个碱基对组成，包含一段长1071bp的开放阅读框(ORF)，3′端含有加尾信号AATAAA和ply(A)尾巴。Northern杂交显示，在Hela细胞和肾上腺组织中有表达的novHmRNA，大小约为2．5kb；多组织RNA点杂交分析结果进一步表明，novH基因在肾上腺和主动脉中的表达水平相对较高，在成人肾、肝、肺和小肠组织中亦有少量的表达。     

碱性蛋白酶高产菌株的选育

以利福平抗性及牛奶平板上产生的透明水解圈的大小作为选择标记，用钴60对本实验室筛选获得的碱性蛋白酶高产菌株地衣芽孢杆菌C6进行诱变处理，筛选获得了一株酶产量大幅度提高的菌株L106，经发酵条件优化，其产酶活性稳定在19000U／mL左右，是出发菌株的1．9倍．与出发菌株相比，该菌的发酵周期也有所缩短，而产酶的最适温度和最适pH保持不变，并保持了芽孢形成较少的优良特性，具有良好的实际应用潜力。     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.     

北美海蓬子甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达载体构建

以北美海蓬子种子为材料, 采用RACE技术获得北美海蓬子BADH基因的cDNA全长序列. 结果表明: BADH基因cDNA全长为1836bp, 其中开放阅读框(ORF)为1503bp, 编码500个氨基酸, 预测蛋白的分子量为54.5kDa, 理论等电点为5.31. 推测出BADH氨基酸中含有甜菜碱醛脱氢酶家族高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)及与酶功能相关的半胱氨酸残基(Cys). 序列比对和系统进化树显示, 北美海蓬子与盐节木和盐穗木的亲缘关系最近, 同源性达94%. 并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-BADH, 将其成功导入到农杆菌EHA105中, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

水稻高温、干旱响应基因OsHdr5的克隆与表达谱分析

低温、高温、干旱等非生物逆境通常会严重影响到水稻的生长及产量.为深入了解水稻逆境反应的分子机理和挖掘耐逆相关基因,本文采用Affymetrix水稻表达芯片对水稻多逆境下的全基因组表达谱进行分析,并筛选出众多表达特异基因.OsHdr5是其中一个在多个生长发育时期与组织器官中受高温、干旱诱导均显著上调的基因,用实时定量PCR方法(real-time PCR)对其表达水平进一步分析,两组结果基本吻合.用PCR方法扩增获得长为743bp的全长基因序列,其ORF区编码167个氨基酸残基,组成的肽链含有磷酸化激酶位点,形成的二级结构包含一个由6个α螺旋和2个β折叠组成的跨膜结构域,进一步分析推测其可能是叶绿体膜上与细胞跨膜信号传递相关的功能蛋白.     

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒的增殖 ,纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒 提纯的病毒粒子经SDS 酚抽提 ,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA ,低熔点琼脂糖电泳法回收纯化编码多角体蛋白的第十片段S10 S10经DMSO变性 ,逆转录合成cDNA第一条链 ,PCR扩增后 ,克隆在PMD18 T载体上 ,克隆片段全长 76 3bp 起始密码AUG位于第 3～ 5位碱基 ,终止密码UGA位于第 74 7～ 74 9位碱基 推测DpwCPV多角体蛋白基因编码一段由 2 4 9个氨基酸组成的多肽 ,分子质量为 2 84 39.4 4× 10 3 与舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)多角体蛋白基因比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 97% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 99% ;与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)多角体蛋白基因相比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 88% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 97%     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

bop基因及其上游启动子的克隆与表达

应用重组PCR的方法，直接从盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)S9的基因组DNA上扩增到了编码细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)的基因——bop基因及其启动子部分(1196bp)，并将其克隆到表达载体pXLNovR后，在宿主菌株中得到了表达．测序结果表明，扩增得到的片段与NCBI数据库中的bop基因及启动子的序列完全相同，且其表达产物的分子量与野生型BR蛋白的分子量一致，并且在568nm处表现出BR蛋白特征吸收峰．本方法与其他方法(如逆转录PCR，建立基因文库后从中调取等方法)相比具有操作简便，成功率高的优点．     

家猫ACE2基因克隆、测序及生物信息学分析

本研究从家猫组织中扩增并鉴定血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）基因，为阐明SARS相关冠状病毒（SARS-CoV）感染家猫的机制提供理沧依据．从家猫肺脏中提取总RNA，以Oligo dT-Adaptor为引物合成第一链cDNA，根据人及小鼠的ACE2基因mRNA序列设计系列引物，通过聚合酶链式反应，分段扩增出家猫ACE2基因的编码区的特异性片段并测序鉴定．家猫ACE2基因mRNA编码区共包括2418个核什酸，推测编码蛋白含805个氨基酸残基．其氨基酸序列与人、小鼠、大鼠ACE2氨基酸序列的同源性分别达到85％，81％和81%．利用多种生物信息学工具软件对家猫ACE2蛋白的理化及生物学性质进行分析．比较人、家猫、果子狸、小鼠、大鼠等ACE2序列中与SARS-CoV结合有关的3个功能区，发现家猫ACE2与人ACE2的同源性最高，提示家猫ACE2在SARS病毒跨种感染中可能发挥重要作用．