伴刀豆球蛋白-糖蛋白特异性识别作用构筑的多层膜及其在生物传感器制备中的应用

研究了伴刀豆球蛋白-糖蛋白特异性分子识别作用构建的多层膜及其在葡萄糖生物传感器制备中的应用.结果表明,含有糖残基的葡萄糖氧化酶可以通过识别作用组装进入多层膜,不含糖基的过氧化氢酶经过化学修饰引入麦芽糖残基,也可以通过分子识别作用组装到多层膜中.对于多层膜厚度研究的结果表明,膜的厚度随层数的增加呈线性关系.研究了多层膜的表面形貌,并讨论了膜结构与功能的关系.伴刀豆球蛋白-酶多层膜修饰的金电极的电化学实验表明,多层膜中的酶具有催化活性.过氧化氢酶/葡萄糖氧化酶串联组装的生物传感器能够有效消除样品中过氧化氢对葡萄糖测定带来的干扰.     

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定牛甲状腺球蛋白的分子量

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定了牛甲状腺球蛋白的纯度与相对分子量.选择芥子酸为适宜的基质,并对所得的结果进行了讨论.实验结果表明分析方法具有灵敏度高、重现性好、信息直观等特点,明显优于其他传统测定蛋白质的方法.     

香豆素类新基质在基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱测定多糖和糖蛋白中的应用

将几种香豆素类新基质(香豆素、3-羟基香豆素(3-HC)、3-氨基香豆素(3-AC)、3-羧基香豆素(3-CC)和4-甲基-7-羟基香豆素(4-M-7-HC))分别应用于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI TOF-MS)测定葡聚糖和3种糖蛋白的研究.香豆素和3-羟基香豆素分别与2,5-二羟基苯甲酸(DHB)混合组成2种二元基质,极大地改善了基质和葡聚糖样品的共结晶状况,样品分布更加均匀.葡聚糖样品更易解吸/电离,每个激光点照射样品均能产生较强的质谱信号,且谱图重现性更好,得到了理想的MALDI TOF-MS谱图.当香豆素类基质用于分析糖蛋白时:3-HC和4-M-7-HC是测定糖蛋白A的优异基质,能检测到m/z 为66 672 Da 的离子信号.而3-AC测定糖蛋白B的基质效果比糖类分析常用基质2,5-二羟基苯甲酸更好.因此,这些香豆素类化合物将为MALDI TOF-MS分析多糖和糖蛋白提供更多新基质选择.     

亲和标记-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于蛋白质相对定量方法的研究

将亲和标记技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱联用,建立了蛋白质相对定量方法,以牛血清白蛋白为实验对象,考察了该方法的准确度、重现性等指标;又以数种标准蛋白混合物为研究对象,考察了该方法的动态范围及相应的标准偏差,为实际生物样品中差异蛋白质分析奠定了基础。     

糖蛋白糖基化位点及糖型的多重质谱分析

以糖蛋白核糖核酸酶B(RNase B)为研究对象,采用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)的碰撞活化解离(CAD)和电子转移解离(ECD)多种质谱技术对RNase B的糖肽的完整信息进行解析.通过多种质谱相互验证,确定了RNase B的糖肽组分的氨基酸序列为SRNLTK、糖链结构为(HexNAc)2(Hex)5-(HexNAc)2(Hex)9及糖基化位点为第34位氨基酸残基.本方法为糖蛋白结构的全面解析提供了一种快速、有效、全面的研究思路.     

基于MALDI-TOF MS的串联富集策略在磷酸化蛋白组学中的应用

提出一种除盐-富集串联用于磷酸肽富集研究的思路。选用C18柱和铈(Ⅳ)修饰的壳聚糖材料进行脱盐实验,以制备的基于聚合物基体螯合Fe3+的亲和色谱材料为富集材料。将直接富集和串联策略应用到标准品和血清中,研究结果表明,该富集材料具有高选择性和高灵敏度(1.6 fmol),铈(Ⅳ)修饰的壳聚糖材料前提下的串联策略能明显降低样品的复杂性。相比直接富集方法,能够提高磷酸化肽的覆盖率。     

β2-微球蛋白连续表位的免疫亲和质谱研究

采用Endoproteinase Glu-C, Lys-C和Trypsin 3种蛋白酶分别水解β2-微球蛋白, 产生一系列肽段, 利用固定在琼脂糖珠上的单克隆抗体与其发生免疫亲和反应. 利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术, 对抗原决定簇肽段-抗体复合物进行系统研究, 结果表明, 与抗体结合部位即连续表位的位点为肽段(59~69)(DWSFYLLYYTE). 该研究方法简便、准确, 可用来对其它抗原连续表位的快速测定.     

基质辅助激光解吸电离质谱和电喷雾电离质谱在辣根过氧化物酶糖肽结构分析中的应用

糖链结构的质谱解析是今后糖蛋白分析中的重要研究内容,其中完整糖肽的分析,由于可以同时获得糖基化位点和对应糖链的结构信息,更具有重要意义和研究前景。本工作对质谱软电离技术在完整糖肽分析中的应用进行了研究,其中包括了基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)和电喷雾电离(electrospray ionization, ESI)技术。通过平行使用两种串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)分析策略: MALDI-MS/MS和ESI-MS/MS对目标糖蛋白——辣根过氧化物酶进行分析,并讨论了其互补性。结果表明,MALDI和ESI技术各有优劣,结合串联质谱分析,可获得糖肽的糖链结构信息;两条路线互补使用,在揭示蛋白质糖基化修饰(位点和结构)的研究中十分必要。     

疏水型色谱饼对人血清蛋白质组学样品的快速分离与制备

建立了疏水型色谱饼(10 mm×20 mm i.d.)与反相色谱(RPLC)离线二维色谱快速分离制备人血清蛋白质组学样品,并用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行检测的方法。以4种标准蛋白质的稀溶液为模型进行分离富集,得到细胞色素c(Cyt-c)与肌红蛋白(Myo)的检出限均为1 pmol/μL,溶菌酶(Lys)和胰岛素（Ins）的检出限为0.1 pmol/μL。将此方法用于人血清蛋白质组学样品的分离与制备,随着血清处理量的增大,质谱可检出的组分数目与信号强度均增加,当血清处理量达到1.0 mL时,可检出低丰度蛋白质或多肽285个(相对分子质量均在15000以下)。研究中将1 μg Cyt-c加入到0.5 mL血清中,用上述方法在分离富集低丰度Cyt-c上取得了很好的效果。结果表明,采用疏水型色谱饼与反相色谱联用技术不仅可对血清样品中低丰度蛋白质进行有效的分离和富集,而且一次样品的处理量大,可显著提高低丰度蛋白质的分析、检测水平。     

基于MIL-100(Fe)的磁性纳米碳材料的制备及其在内源性肽富集中的应用

以Fe₃O₄为核，采用层层自组装的方法合成核壳型Fe₃O₄@MIL-100（Fe）磁性纳米材料，经高温煅烧得到具有较大孔径（17.78 nm）、高含碳量（6.79%）的磁性纳米材料Fe₃O₄@MC。将该材料用于多肽的富集，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）进行鉴定。Fe₃O₄@MC材料从牛血清白蛋白（BSA）酶解液中富集得到33条肽段，且具有较高的选择性（BSA酶解液与BSA的质量比为1：400），用于人血清中内源性肽段的分离富集也取得了较好的效果。     

多金属氧酸盐/壳聚糖磁性复合材料的制备及其用于磷酸化肽的富集

建立了一种基于多金属氧酸盐磁性材料富集磷酸化肽的方法。采用层层自组装技术制备多金属氧酸盐/壳聚糖磁性材料,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测手段,用于磷酸化肽的富集。该磁性材料具有快速磁响应、亲水性、正电性等优点,对磷酸化肽具有高的富集选择性。实验用β-酪蛋白作为模型蛋白质,通过富集后,方法的检出限为0.02 fmol,说明合成的磁性材料对微量蛋白样品分析具有很高的应用潜力。     

基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在微生物鉴定中的应用*

基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种新型软电离生物质谱,具有检测速度快、操作简便、结果准确等优点,目前已成为可靠的微生物快速鉴定技术。就工作流程而言,与常规生化方法相比,MALDI-TOF MS可以将微生物鉴定的时间缩短为一天甚至更短。对于具有抗生素耐药性的微生物,使用MALDI-TOF MS鉴定也有很好的准确性。在病毒鉴定中,MALDI-TOF MS也可以发挥作用,已有报道将MALDI-TOF MS和机器学习(ML)分析方法结合来检测鼻拭子中SARS-CoV-2。此外,MALDI-TOF MS还可用于细菌的无光谱库鉴定。目前,MALDI-TOF MS正通过与其他技术(例如傅里叶红外光谱FTIR)相结合进一步扩大微生物鉴定范围。     

MALDI-TOF质谱准内标法及其用于rhTPO复杂糖一致性研究

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)准内标法准确测定重组人血小板生成素(rhTPO)仿制药和原研药中4类糖修饰的相对含量,并进行样本间和批间一致性比较。结合多种切糖酶逐步切除rhTPO的N-糖、唾液酸和O-糖;以牛血清白蛋白(BSA)为标准品,与样本非混合点靶;采用MALDI-TOF质谱准内标法检测,分别获得各样本完整含糖分子量及不同层次切糖后分子量;通过分子量差值计算4类糖修饰的相对含量;最后比较仿制药与原研药样本间和批间一致性。以BSA多电荷峰对rhTPO切糖前后的MALDI-TOF质谱测定值进行准内标法校正,BSA多电荷峰之间相对标准偏差(RSD)均≤0.075%,批间RSD为0.001%~0.004%,方法误差均0.01%。rhTPO仿制药N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相对含量分别约为24.6%、2.9%、9.0%和5.1%,批间一致性良好,且总糖含量与文献值一致;rhTPO原研药N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相对含量分别约为25.6%、2.9%、7.9%和3.5%,总糖含量较文献值偏低。与rhTPO原研药相比,仿制药糖基化糖相对含量基本一致,糖化糖含量有差异。rhTPO糖化糖研究未见文献报道,其差异是不同厂家rhTPO之间差异的重要因素,主要由发酵工艺差异导致。     

反相高效液相色谱法测定康肾颗粒中的葛根素

建立了反相高效液相色谱分离、质谱定性、紫外检测定量测定康肾颗粒中葛根素含量的方法。采用YMC-ODS色谱柱(4.6 mm i.d.×100 mm,10 μm),选用甲醇(含0.1%三氟醋酸)和水(含0.1%三氟醋酸)体系为流动相,非线性梯度洗脱分离,流速1.0 mL/min,检测波长250 nm;用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析鉴定对照品和样品的馏分,在确定目标峰后进行紫外检测定量测定。结果表明,葛根素在0.132 ~1.32 μg范围内其峰面积与进样量呈良好的线性关系（r=0.9997）,平均加标回收率高于103%,相对标准偏差低于2.0%(n=6)。应用该方法测定康肾颗粒中葛根素,其平均含量为3.09 mg/g。该方法简单、快速、重现性好。     

一种液相色谱分离与质谱鉴定白血病K562细胞蛋白的方法

分别通过3种色谱模式:反相高效液相色谱(RPLC)、弱阴离子交换-反相高效液相色谱(WAX-RPLC)和排阻-反相高效液相色谱(SEC-RPLC)对K562细胞的蛋白质进行分离,收集的色谱馏分采用基质辅助电离解析时间飞行质谱(MALDI-TOF MS)进行鉴定后,比较所获得的蛋白质数据.结果显示:当选择SEC-RPLC模式构建K562细胞蛋白质图谱时,检测到的蛋白质数目最多,信息最为全面.此法的建立为白血病的临床研究提供了一种有效的手段.     

高效液相色谱-基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱分离鉴定牛乳铁蛋白素

建立了高效液相色谱-基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)分离鉴定牛乳铁蛋白素(bovine lactoferricin, LfcinB)的方法。采用胃蛋白酶酶解牛乳铁蛋白,酶解液离心后取上清液,经过离子交换色谱、反相液相色谱、透析等技术分离,对分离得到的目标产物进行抗菌活性分析、蛋白含量测定和MALDI-TOF/TOF MS鉴定。分离得到高活性的LfcinB,其相对分子质量为3124.89,蛋白含量为18.20 μg/mL。本方法具有精度高、分析速度快和分辨能力强等优点,是其他传统的分析鉴定LfcinB方法所无法比拟的,为进一步研究LfcinB奠定了基础。     

Affinity labeling coupled with matrix assistant laser desorption tandem time of flight mass spectrometry for quantitative proteomics research

A relative quantitative method for differential proteomics by cleavable isotope-coded affinity tag (cICAT) and matrix-assisted laser desorption/ionization tandem timeof-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) was established. The accuracy and reproducibility of the method were evaluated by bovine serum albumin (BSA) digest as having a relative standard deviation of less than 30% and good reproducibility. The dynamic range was also evaluated by analyzing two mixtures of several standard proteins with different concentration. The experimental results showed that in the dynamic range of 1:30, the quantitation error of the method was less than 30%. Although the quantitation error becomes very large when used beyond this range, it does not affect the derivation of information on the differential proteins. All the work provides an alternative method for differential proteomics analysis in biological samples from different origins. __________ Translated from Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2006, 34(7): 899–904 [译自: 分析化学]     

Ti-SBA-15介孔材料用于磷酸化肽的高效富集

结合基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测技术,考察了Ti-SBA-15介孔材料对β-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的选择性富集性能。实验结果显示,含Ti和Si物质的量比为0.08的Ti-SBA-15介孔材料可选择性地对β-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽进行选择性富集;对于β-酪蛋白和牛血清白蛋白物质的量比为1:100的蛋白质酶解混合液,Ti-SBA-15仍能实现对其磷酸化肽的有效富集。上述结果表明,作为一种多孔、高比表面积的磷酸化多肽的选择性吸附材料,Ti-SBA-15有望在磷酸化蛋白质组的分析中得到广泛的应用。     

应用基质辅助激光解吸质谱快速分析重组水蛭素产物的纯度与分子量

利用MALDI－TOF－MS测定了具有抗凝血活性的水蛭素基因重组产物（rHV-2)的纯度和分子量，实验测定结果与理论计算值一致，证明此基因重组产物的一级结构是正确，在表达，复性和纯化的过程中没有氨基酸的选择，变异和修饰。     

反相高效液相色谱/基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 分离鉴定螺蛳血管紧张素转换酶抑制肽

运用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对酶解螺蛳腹足肌得到的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽进行两步分离提纯,第一步主要得到8个组分;选取其中活性最高的组分进一步分离,得到2个组分,其中活性较高组分的ACE半抑制浓度为43.5 μmol/L,基本为单一肽组分。对提纯的组分分别使用高效液相色谱/电喷雾离子质谱法(HPLC/ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)进行分析,同时结合氨基酸组成分析结果,最终得到的肽链一级结构为Lys-Glu-Ile-Trp(KEIW),符合已知的高活性ACE抑制肽的结构规律。经过对两种方法分析过程的比较,认为ESI-MS可以得到多方面的信息,但无法确定肽的序列;MALDI-TOF MS可以得到精确的二级质谱图(m/z精确至0.0001),从而可以得到确定的肽的序列。