免疫亲和质谱法研究／β2-微球蛋白抗原表位

采用免疫亲和分离与质谱分析相结合的方法,对β2-微球蛋白抗原表位进行了系统研究.完整的抗原分子和已固定在载体(CNBr-activated Sepharose beads)上的单克隆抗体发生免疫亲和反应后,用Endoproteinase Glu-C,Trypsin,AminopeptidaseM和carboxypeptidase Y四种不同的蛋白酶依次酶解抗原分了,并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对与抗体连接受保护而未发生水解的肽段进行了研究.结果表明:β2-微球蛋白抗原表位位于整个蛋白分了氨基酸序列的61～67位,即为SFYLLYY.通过合成肽段的分析,证明了SFYLLYY即为抗原表位,与亲和质谱方法分析结果一致.     

β2-微球蛋白连续表位的免疫亲和质谱研究

采用Endoproteinase Glu-C, Lys-C和Trypsin 3种蛋白酶分别水解β2-微球蛋白, 产生一系列肽段, 利用固定在琼脂糖珠上的单克隆抗体与其发生免疫亲和反应. 利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术, 对抗原决定簇肽段-抗体复合物进行系统研究, 结果表明, 与抗体结合部位即连续表位的位点为肽段(59~69)(DWSFYLLYYTE). 该研究方法简便、准确, 可用来对其它抗原连续表位的快速测定.     

质谱技术在免疫分子的结构研究中的应用

质谱技术用于生物大分子的研究具有直接、简单、快速、经济等优点。近十年来 ,基质辅助激光解吸质谱 (MALDI MS)和电喷雾质谱 (ESI MS)在免疫学领域的研究中作出了重要贡献。本文着重对抗原、抗体、抗原 抗体复合物、抗原决定簇等免疫分子结构的质谱研究作一评述。大体分为四方面内容 :免疫分子的分子量、翻译后修饰、异质性、构象变化的分析 ;质谱指纹图的取得和串联质谱测序 ;抗原 抗体复合物的证明 ;B 细胞表位和T 细胞表位序列的测定。这些研究结果对于理解免疫分子的免疫功能、对于疾病的早期诊断、对于发展新药和疫苗具有重要意义     

β-伴大豆球蛋白的N-糖基化位点及其N-糖链的质谱分析

以β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)为研究对象,利用Trypsin和Pepsin酶对其进行水解,以Con A亲和层析柱富集纯化糖肽,并用糖苷酶PNGase F和Endo H分别酶解糖肽,再采用电喷雾质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对所得肽段的氨基酸序列及糖链的结构进行了分析,最后通过数据库检索对分析结果进行验证.结果表明,β-conglycinin具有5个N-糖基化位点,分别为α亚基的199和455位天冬酰胺(Asn),α'亚基的215和489位Asn及β亚基的326位Asn,且每个糖基化位点均被H5N2,H6N2,H7N2和H8N2这4种高甘露糖型N-糖链所修饰.本研究为各种糖蛋白的糖基化位点及其对应的糖链结构的鉴定分析提供了方法参考,并为深入理解大豆糖蛋白抗原表位的特异性及致敏机理提供了依据.     

非对称流场流分离-超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱用于过敏原蛋白表位筛选

应用非对称流场流分离（AF4）技术结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）对过敏原蛋白表位进行筛选。将选择的过敏原蛋白（虾原肌球蛋白，TM）酶解后经UPLC-QTOF-MS分析，建立蛋白质肽谱。将TM酶解后的肽段与免疫球蛋白E混合孵育30 min，孵育过程中含有抗原表位的特异性肽段与免疫球蛋白E（IgE）结合，未结合的肽段仍留在溶液中。将孵育后的溶液进行AF4分离，已结合的肽段随IgE一起由出口流出，未结合的肽段透过分离通道膜，滤出至废液。收集出口流出的组分进行UPLC-QTOF-MS分析，与蛋白质肽谱匹配，找到特异性肽段，进而检测抗原表位。本研究扩展了非对称流场流分离技术的应用，对过敏原蛋白表位的检测进行了初步探索，为过敏原蛋白表位的研究提供了一种新的研究策略。     

HLA-A*0201限制性CTL表位肽的三维定量构效关系的研究

运用比较分子力场(CoMFA)和比较分子相似性指数分析(CoMFA)方法研究了50个HLA-A^*0201限制性CTL表位九肽结构与亲和性间的关系,另外15个表位九肽作为预测集用于检验模型的预测能力.结果表明采用CoMSIA得到的构效关系模型(q^2=0.628,r^2=0.997,F=840.419)要明显优于采用CoMFA得到的构效关系模型.在CoMSIA计算中,当引入疏水场时,三维构效关系模型得到明显改善,通过该三维构效关系模型,可较精确地估算预测集中15个CTL表位肽与HLA-A^*0201间的亲和力(r^2pred=0.743).通过分析分子场等值面图在空间的分布,可以观察到表位肽分子周围的立体及疏水特征对表位肽与HLA-A^*0201间结合亲和力的影响,从而为进一步对CTL表位肽进行结构改造并基于此进行治疗性疫苗分子设计提供理论基础.     

基于VHSE结构表征的TAP亲和活性预测及选择特异性分析

应用氨基酸描述子VHSE(Principal component score vector of hydrophobic, steric, and electronic properties)对613个抗原9肽进行结构表征, 在此基础上, 采用支持向量机结合逐步回归变量筛选方法, 成功建立了抗原肽抗原处理相关转运蛋白(Transporter associated with antigen processing, TAP)亲和活性预测模型, 最优线性支持向量机模型的R2, Q2和R2ext分别为0.7386, 0.7270和0.6057. 模型结果分析表明, 影响TAP亲和活性的首要因素是电性, 其次是立体和疏水性质; 底物9肽的P1(N端)及P2, P7和P9(C端)位氨基酸物化性质对TAP亲和活性有重要影响, 而P3, P4, P5和P6位对模型贡献相对较小, P8位则与活性无关. 依据最优模型对模拟点突变9肽的TAP亲和活性的预测结果, 并结合变量载荷分析, 对TAP底物选择特异性进行了分析和总结.     

磷酸化肽段分离富集方法研究进展

目前磷酸化肽段鉴定主要依赖于质谱技术,但磷酸化肽段的低丰度性以及来自非磷酸化肽段的干扰等因素,影响质谱的分析与鉴定。因此质谱分析前磷酸化肽段的富集,是深入研究磷酸化蛋白质组学的先决条件。该文介绍了磷酸化蛋白质组学中传统的以及新建立的一些磷酸化肽段分离富集方法的原理及优缺点,这些方法包括固相金属离子亲和色谱法(IMAC)、金属氧化亲和色谱法(MOAC)、强阳/阴离子交换色谱法(SCX/SAX)、亲水相互作用色谱法(HILIC)、静电排斥亲水相互作用色谱法(ERLIC)、化学衍生法、MALDI靶盘富集法以及多种富集方法相结合。     

抗原肽与MHC分子相互作用QM/MM分子动力学模拟研究

在MHC I类(major histocompatibility complex class I)分子抗原加工提呈过程中抗原蛋白在抗原提呈细胞(antigen-presenting cells, APC)的胞浆中被蛋白酶体(proteasome)裂解成短肽peptide, 由转运相关蛋白(transporter associated with antigen processing, TAP)将蛋白酶体裂解产生的短肽片段从胞浆转运至内质网腔. 短肽peptide在内质网中与新生成的MHC I类分子结合, 形成peptide-MHC复合体被提呈到APC细胞表面, 与T细胞表面抗原受体(T cell receptor, TCR)特异性识别结合, 使得CTL细胞开始活化、增殖、分化, 进而对肿瘤细胞进行特异性杀伤. 目前对CTL细胞如何识别抗原肽-MHC复合物分子及抗原短肽peptide如何与主要组织相容性复合体MHC分子的相互作用识别结合的机理还不是很清楚. 传统的预测CTL细胞表位的方法没有考虑受体与配体结合过程中电子结构的变化, 电子结构的变化需要用量子力学方法来处理. 本文采用QM/MM多尺度生物大分子的分子动力学模拟方法, 以天然抗原肽TAX (LLFGYPVYVYU)与HLA-A*0201分子结合的晶体结构为模板, 替换抗原肽“锚点”氨基酸, 将口袋氨基酸残基的原子极化电荷在空间形成的静电势用电多极矩分量表示. 用箱线图分析每个口袋氨基酸分子静电势变化和功能, 确定Pocket B的Glu63和Lys66的功能是精细识别氨基酸和一级结合氨基酸, Pocket F的Asp77, Tyr84的功能是精细识别氨基酸, 而Asp77, Lys146是一级结合氨基酸, 表明QM/MM方法在提取抗原肽与MHC I类分子识别结合特异性信息是可行的, 这对了解免疫识别机理和指导肿瘤疫苗的开发都具有指导意义.     

基于ISC-SVR方法预测Th细胞表位

外源性抗原蛋白被抗原提呈细胞(APC)摄取送入溶酶体中被降解为长度不一的肽段. 在HLA-DM分子辅助下, MHC II类分子相关恒定链多肽(class II-associated invariant chain peptide, CLIP)从MHC II类分子的肽结合槽解离, 使得外源性抗原降解的肽段进入MHC II类分子空的肽结合槽中, 形成稳定的抗原肽-MHC II类分子复合物. 之后再被提呈到APC细胞表面供CD4⁺Th细胞的TCR识别, 激活Th细胞分泌细胞因子, 促进CTL细胞特异性杀伤靶细胞或辅助B细胞产生抗体. Th细胞的活化对机体的细胞免疫和体液免疫功能都有重要的辅助作用. 本工作基于迭代自洽策略与支持向量回归机(ISC-SVR)方法建立了MHC II类分子与外源性抗原肽结合亲合力预测模型, 采用13mer扩展核心结合序列可以提高预测模型的性能, 分别按照均值法、最大值法、结合法、加权平均值法4种方法计算MHC II类分子与抗原肽的结合亲合力值. 对17种MHC II类分子配型进行了回归分析, 与其他预测模型相比较, 本工作模型都得到了最佳AUC值. 最后, 以HLA DRB1*0101分子为例, 分析讨论了MHC II类分子与抗原肽的结合特异性.     

固定化酶微升反应器与MALDI-TOF MS联用技术用于蛋白质肽谱研究

以甲基丙烯酸缩水甘油酯新型复合纤维素膜为介质固定化胰蛋白酶, 与传统微球固定化酶反应器相比, 提高了分子扩散传质性能. 设计并制成固定化酶微升反应器, 并与基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)联用应用于蛋白质的肽谱分析. 将所获得的肽质谱图用于蛋白质数据库检索, 可以确定各肽段在蛋白质中的位置. 这种方法尤其适用于高灵敏度和微量生物样品的快速分析, 可以在皮摩尔的水平上对蛋白质的结构进行鉴定.     

新型氨基甲酸乙酯人工抗原的分析表征方法研究

采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺方法合成氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)新型人工抗原.将衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)应用于人工合成抗原的表征分析,并结合荧光光谱分析EC人工抗原的偶联效果以及载体蛋白质分子的二级结构变化;通过质谱结合紫外光谱、电泳方法进行人工抗原的系统表征,计算新型人工抗原中半抗原分子与载体蛋白质分子的偶联比.结果表明:合成路线合理,成功获得了氨基甲酸乙酯新型人工抗原.人工抗原分子的α-螺旋、β-折叠和β-转角结构与载体蛋白质分子相比含量发生变化,人工抗原的荧光相图满足线性型态变迁关系,符合“二态模型”.氨基甲酸乙酯人工抗原分析表征的红外衰减全反射方法、基质辅助激光解析飞行时间质谱法获得的检测结果与其它光谱方法、电泳方法表征结果一致,获得人工抗原的偶联比为15∶1～19∶1,EC新型人工抗原免疫小鼠抗血清的效价为1∶25600.     

新型亲和去垢小柱净化-液相色谱-串联质谱法分析水稻叶片蛋白质组

采用亲和去垢小柱净化,建立了水稻叶片蛋白质组的纳升液相色谱-串联质谱分析方法。水稻叶片蛋白质分别采用酚提取法结合十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)裂解,裂解液经亲和去垢小柱净化,酶解肽段用纳升液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱(nanoLC-LTQ/Orbitrap MS)分析,相关数据库检索鉴定。比较了超滤辅助样品制备法(FASP法)、亲和去垢小柱法和丙酮沉淀法对SDS去除效率及对蛋白质鉴定结果的影响。结果表明:3种方法均有较好的SDS去除效果(去除效率均大于95%);尽管3种方法鉴定的蛋白质种类具有一定的互补性,但以亲和去垢小柱法鉴定的蛋白质数目最多,为563种,远多于FASP法和丙酮沉淀法的196和306种;此外,亲和去垢小柱法适合于各种相对分子质量和不同pI值蛋白质的净化,而FASP法和丙酮沉淀法中不同相对分子质量和pI值蛋白质均有类似程度的损失。采用本文建立的方法,一次进样分析可鉴定出水稻叶片蛋白质多达588种;肽段匹配数≥2的296个蛋白质的生物学功能主要分为结合活性、酶活性、转移运输活性和结构组成等。该蛋白质分析方法可为开展水稻蛋白质组学研究提供技术参考。     

溶剂诱导黑色素瘤抗原基因-2特定表位多肽异构的LC/MS研究

 研究乙醇、甲醇两种常用溶剂系统对固相合成的黑色素瘤抗原基因 2 (MAGE 2 )的特定表位多肽 (171 179)异构的影响。分别运用乙醇、甲醇溶剂体系以及极性溶剂二甲基亚砜 (DMSO)作对照预处理固相合成的黑色素瘤抗原特异性MAGE 2表位多肽 (171～ 179) ,然后用反相高效液相色谱 /质谱联用技术 (RP HPLC/MS)对合成的表位多肽的m/z进行Q1正离子监测扫描分析 ,观察其在不同溶剂系统预处理下的异构情况 ,以选择合理的预处理条件。结果发现采用乙醇及甲醇溶样时MAGE 2表位多肽有异构体产生 ,极性溶剂DMSO溶样的表位多肽未有异构现象发生。     

基于特征肽段的液相色谱-质谱技术鉴定胶原蛋白的物种来源

建立了一种基于特征肽段的液相色谱-质谱技术鉴定胶原蛋白物种来源的方法。样品经蛋白提取,还原,烷基化,胰蛋白酶消化后,采用Eksigent C18色谱柱(75μm×150 mm,3μm)分离,用流动相0. 1%甲酸水-乙腈溶液(98∶2)和0. 1%甲酸乙腈-水溶液(98∶2)梯度洗脱,在正离子模式下,通过纳升电喷雾四极杆飞行时间质谱进行检测,数据经Protein PilotTM软件及blast分析,筛选出潜在的特征肽段。消化后的样品再采用Eclipse Plus C18色谱柱(2. 1 mm×100 mm,1. 8μm)分离,用流动相乙腈和1%甲酸水溶液梯度洗脱,在正离子模式下,通过电喷雾四极杆/线性离子阱串联质谱的多反应监测触发增强子离子扫描模式进行检测,进一步确认肽段的特异性。最终筛选并确证了3种猪源性胶原蛋白特征肽段,4种牛源性胶原蛋白特征肽段,1种羊源性胶原蛋白特征肽段。所筛选的特征肽段具有良好的耐热性,可为动物源性胶原蛋白鉴定提供一种特异性强、准确可靠的检测方法。     

低浓度甲醛对多肽和蛋白化学修饰的质谱研究

采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱( MALDI-TOF MS)和纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质谱( Nano-ESI -QTOF MS)技术,以标准肽段和流感病毒基质蛋白酶切肽段为模型,研究了甲醛对蛋白质和多肽主链的修饰作用。采用与实际病毒灭活过程一致的实验条件(4℃,0.025%(V/V)福尔马林(37%(w/w)甲醛溶液)处理72 h),进行甲醛与多肽的化学反应。结果表明,在实验条件下,甲醛能与标准肽段N端的氨基反应生成羟甲基加合物,再发生缩合反应生成亚胺,形成+12 Da的产物。此外,甲醛还能与标准肽段中的精氨酸、赖氨酸的侧链发生反应,生成+12 Da的反应产物。对流感病毒基质蛋白的酶切肽段与甲醛的反应的质谱分析结果显示,多数的肽段都生成了+24 Da的产物,质量的增加来源于肽段N端氨基(+12 Da)和C端精氨酸或赖氨酸的侧链(+12 Da)的贡献。此外,还观察到有一个漏切位点的肽段生成了+36 Da的产物。本研究结果表明,在实验条件下,低浓度甲醛主要与肽段和蛋白的N 端氨基,以及精氨酸和赖氨酸侧链发生反应。本研究为分析低浓度甲醛与蛋白质的反应产物提供了有效的质谱分析方法和解谱依据。     

全二维微柱液相色谱-质谱鉴定人胃癌组织中的差异蛋白质

构建了以阳离子交换色谱-反相色谱(SCX-RPLC)为分离模式的新型全二维微柱液相色谱-质谱分离平台.采用了醋酸铵缓冲液梯度洗脱,实现了第一维肽段的分步洗脱,洗脱的肽段经富集除盐后通过接口进入反相色谱微柱,通过线性梯度实现第二维进一步分离,最后进入质谱进行检测.采用此平台分析了人胃癌组织与正常组织提取蛋白质信息,其中正常胃组织鉴定蛋白质数为537个,而癌症组织鉴定蛋白质数目为506个.对胃癌和正常组织两种提取蛋白质酶解产物的蛋白质检索结果进行比较分析,将鉴定的蛋白质按照物理性质进行分布,找出正常组织与癌症组织间蛋白质差异,筛选出一种可能发生变异的癌症特有蛋白.     

应用独立成分分析方法预测CTL表位

基于独立成分分析方法分别采用3 z-scale和5 z-scale氨基酸结构描述符, 建立了抗原肽与MHC分子(major histocompatibility complex, MHC)相互作用结合的定量构效关系模型. 该两个模型训练集样本数是316, 预测集样本数是786. 结果表明: 3 z-scale模型的预测准确度和AUC值分别为70.3%, 0.70; 5 z-scale模型的预测准确度和AUC值分别为70.9%, 0.79. 本文建立CTL表位预测模型对进一步了解抗原肽与MHC I类分子相互作用机理具有一定的帮助.     

计算机辅助筛选酪氨酸激酶相关蛋白TRP-2 CTL模拟表位

运用多项式方案、量化基序方案等经典的CTL表位筛选方案, 初步筛选了酪氨酸激酶相关蛋白TRP-2 CTL表位TRP-2_180～188 (SVYDFFVWL)的模拟表位, 以通过表位改造提高其与HLA-A2.1分子结合的能力, 从而提高其免疫原性. 根据打分结果, 合成了4个得分较高的九肽序列, 亲和力实验结果表明所筛选的4个序列较原序列均有较高的亲和力, 但对2位的单突变结果较1和2位双突变结果理想, 进一步运用分子模拟方法对4个序列与HLA-A2.1分子间的相互作用进行了分子模拟分析, 分子模拟结果较好地解释了上述实验现象, 从而为进一步的结构改造提供了理论依据. 本研究提供了一个合理高效的模拟表位筛选方法.     

表面等离子共振-质谱法对相互作用的生物分子在10-15mol水平的微量鉴定

利用生物传感芯片质谱法(BIA/MS)对微球蛋白及其抗体的相互作用进行分析和鉴定.将微球蛋白抗体偶联到芯片上,让微球蛋白溶液流过芯片表面,然后使用“三明治”结构的微再生方法把结合的微球蛋白从芯片上洗脱下来,再对其进行酶解及质谱鉴定,在10-15mol水平得到了明确的结果.