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测定全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平对于研究环境污染物暴露的影响及致病机理具有重要的作用。本文建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)同时测定动物组织中全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平的方法。从动物组织样品中提取DNA,并将其酶解成单核苷,利用液相色谱-串联质谱法测定5-甲基胞嘧啶核苷、5-羟甲基胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷的含量,计算全基因组DNA甲基化率和羟甲基化率。利用该方法研究了砷暴露对大鼠肝脏和小脑全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平的影响,得到了砷影响DNA甲基化及羟甲基化的初步数据。该方法具有良好的重现性、灵敏度和稳定性,可以同时检测差异较大的DNA甲基化和羟甲基化水平。为同时研究DNA甲基化和羟甲基化水平提供了有力的支持。 相似文献
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液相色谱-串联质谱分析组织中基因组脱氧核糖核酸羟甲基胞嘧啶水平 总被引:1,自引:0,他引:1
5-羟甲基胞嘧啶通过阻止脱氧核糖核酸(DNA)甲基化转移酶1(DMNT1)甲基化胞嘧啶来影响DNA甲基化的程度。本文建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定组织中全基因组5-羟甲基胞嘧啶水平的方法。采用苯酚-氯仿提取组织DNA,提取的DNA用88%甲酸在140 ℃下裂解,DNA裂解液加入同位素胞嘧啶作内标,经N2吹干后,加乙腈-水(9:1, v/v)溶解,用LC-MS/MS检测5-羟甲基胞嘧啶的含量,并计算全基因组中5-羟甲基胞嘧啶的水平。结果表明,5-羟甲基胞嘧啶的线性范围为0.1~30 ng/mL,相关系数为0.9969,检出限(信噪比为3计)和定量限(信噪比为10计)分别为0.057 ng/mL和0.090 ng/mL;日内相对标准偏差和日间相对标准偏差分别为5.13%和6.24%;加标回收率为90.24%~97.53%。用该方法检测了大鼠大脑组织DNA羟甲基化水平,平均结果为0.66%。该方法简便,重现性好,灵敏度较高,能满足全基因组5-羟甲基胞嘧啶定量检测的要求。 相似文献
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白菜DNA甲基化水平的反相离子对高效液相色谱法研究 总被引:2,自引:0,他引:2
建立了反相离子对液相色谱测定白菜的DNA甲基化水平的方法。采用的色谱柱为HypersilBDSC18柱(200mm×4.0mm,5μm),以pH4.0的甲醇-5mmol·L-1庚烷磺酸钠-三乙胺(10:90:0.2,体积比)的混合液为流动相,UV检测器波长为273nm。通过测定DNA水样所产生的胞嘧啶和甲基胞嘧啶的含量,即可得知DNA甲基化程度。胞嘧啶和甲基胞嘧啶回收率分别为99.6%及103.3%,RSD为3.7%(日内)及5.2%(日间)。 相似文献
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由DNA甲基转移酶(DNMT1)催化的DNA甲基化在许多生物过程中起重要作用,包括基因转录,基因组印记和细胞分化~([1])。本文利用特异性酶切法成功开发了一种有效的测定DNMT1的电化学方法。首先,将硫醇修饰的双链DNA(dsDNA)自组装固定在金电极上,随后DNMT1识别dsDNA半甲基化序列并实现完全甲基化,最后通过甲基化特异性限制酶(BSSHⅡ)剪切,未发生完全甲基化的碱基序列将被剪切并移除电极表面。利用差分脉冲伏安法(DPV)分别测定剪切前后的亚甲基蓝(MB)还原电流。在最佳优化条件下,该方法线性范围为0.5 nM~50 nM,检测限为0.5 nM。这种方法可以简单有效地检测DNA甲基化和DNMT1活性,在DNA甲基化快速检测和基因毒理分析方面具有一定的实际意义。 相似文献
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5-甲基胞嘧啶在哺乳动物细胞中具有广泛的作用.而它被双脱氧家族Tet蛋白氧化所得的产物5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶也被证明在细胞发育和5-甲基胞嘧啶动态平衡调控中具有关键的作用.已有的研究结果表明,Tet蛋白能够识别双链DNA上的5-甲基胞嘧啶,并将其氧化成5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶.我们通过质谱仪检测发现,老鼠Tet1蛋白的DNA结合结构域还能识别和氧化单链DNA上的5-甲基胞嘧啶.这一发现暗示我们,Tet蛋白家族不但具有已经发现的氧化双链DNA上5-甲基胞嘧啶的功能,还有可能作用于DNA的复制及转录,甚至具有氧化单链RNA上对应的甲基修饰碱基的能力. 相似文献
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pEGFP-C3质粒经过体外人工甲基化处理后,被转染进入HepG2细胞以构建重组细胞株.以5-AZA为阳性去甲基化毒物与重组细胞共培养,通过亚硫酸氢钠测序法定量检测EGFP基因启动子区甲基化状态,通过实时定量PCR检测EGFP基因表达,借助流式细胞术和荧光摄片定量检测共培养细胞的绿色荧光强度,在DNA甲基化、EGFP基因mRNA表达、GFP蛋白等多个层次研究5-AZA染毒处理与其去甲基化能力和荧光表达改变的响应关系.对天津污染水产的去甲基化能力进行了实际样品测试.结果表明,5-AZA与重组细胞的DNA甲基化、基因表达、蛋白产物变化之间存在显著关联,具有较低的检出浓度和良好的重复性.天津污染海域的水产去甲基化能力较强.本文初步建立了一种污染物去甲基化表观遗传毒性评价方法. 相似文献
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基因组DNA除A、G、T、C四大经典碱基外,还存在上百种稀有碱基。其中,醛基嘧啶(5-醛基胞嘧啶和5-醛基尿嘧啶)是DNA中天然存在的嘧啶类修饰碱基,在哺乳动物细胞中广泛分布。5-醛基胞嘧啶除参与DNA主动去甲基化过程外,还具备独立的表观遗传功能;而5-醛基尿嘧啶通常被认为是一种基因毒性很高的DNA氧化损伤。根据醛基嘧啶的特征结构,有针对性地开发准确、灵敏和简便的检测方法,从全基因组范围内对他们进行定性、定量和区域定位,是进一步明确这类碱基修饰物调控机制的基础和前提。本文从选择性化学标记的角度总结了近年来醛基嘧啶检测方法的研究进展。 相似文献
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基于第一性原理模拟, 我们构建了一种具有石墨烯电极的纳米间隙生物分子传感器件的理论模型. 研究发现,当碱基分子胞嘧啶、甲基化胞嘧啶和羟甲基化胞嘧啶分别通过器件时, 器件横向电流的大小差异约有1个数量级, 器件对此类分子具有一定的分辨能力. 分子之间的区分度大小受单链脱氧核糖核酸(DNA)中相邻碱基分子间的相互作用及碱基分子构型的影响. 研究工作表明, 此类石墨烯基分子传感器可准确高效地区分具有不同结构的碱基分子, 为准确定位DNA链中的变异碱基分子提出了一种新的思路. 相似文献
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p16基因甲基化的芯片定量检测 总被引:3,自引:0,他引:3
p16基因的失活与多种肿瘤相关,但p16基因缺失率较低,突变更为罕见,p16基因启动子区CpG岛甲基化与其蛋白表达密切相关.DNA甲基化已成为目前研究的热点,现有的技术包括:Southernblot法、限制性内切酶-PCR法、DNA测序法、甲基化特异性PCR(MSP)、 相似文献
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DNA甲基化作为表观遗传修饰中一种重要的调控方式,通过调控基因的表达,从而影响机体内一系列的生物学过程。色谱-质谱法是研究DNA甲基化修饰的重要研究手段。随着对哺乳动物DNA甲基化的生物学功能的深入研究,应用于研究表观遗传修饰的手段与仪器设备越来越先进。为了对DNA修饰进行定性与定量的分析检测,除了高效液相色谱整合不同种类质量分析器的质谱联用(HPLC-MS)技术外,目前还开发应用了基质辅助激光解析质谱技术(MALDI-ToF-MS)和气相色谱-质谱联用技术(GC-MS),从而极大拓展了DNA甲基化修饰研究的手段。本文对分析表观遗传DNA甲基化修饰的质谱技术发展进行综述,希望为DNA甲基化修饰分析提供有价值的研究策略。 相似文献
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作为一种强神经毒性物质,环境中的甲基汞(MeHg)主要由产甲烷菌、硫酸盐还原菌、铁还原菌等厌氧微生物产生,可通过水生食物链积累并作用于人体。汞甲基化基因hgcA/B明确以后,不仅扩大了可探知的汞甲基化微生物范围,也为汞甲基化生物分子机制的探索提供了新的方向。本文1)概述了hgcA/B及其表达产物HgcA、HgcB的预测结构和生物体内的汞甲基化分子机制,2)讨论了基于hgcA/B的环境汞甲基化研究进展,3)总结了现有hgcA/B研究存在的不足,4)对汞甲基化基因领域的研究方向进行了展望。 相似文献
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建立了高效液相色谱/紫外法测定刺参组织全基因组DNA甲基化水平的方法,并运用此方法对喹噁啉药物处理过的刺参样品DNA甲基化水平进行分析。色谱条件为:色谱柱为ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250mm;5μm);柱温为30℃;检测波长为280 nm;进样量20μL;流动相为甲醇-7 mmol/L乙酸铵(7∶93),流速为1.0 mL/min。5-甲基脱氧胞苷和脱氧胞苷的质量浓度在0.05~1.0 mg/L范围内时,线性关系良好,相关系数(r)均为0.999 9。5-甲基脱氧胞苷和脱氧胞苷的检出限均为0.05 mg/L,在加标浓度为0.05,0.25,1.0 mg/L时,回收率为90.4%~100.6%,批内、批间相对标准偏差均小于4%。采用CTAB法提取刺参组织DNA,酶解后进行HPLC测定,结果表明:喹噁啉药物处理过的组织样品DNA甲基化水平低于对照组,该类药物通过改变DNA甲基化水平而影响基因的正常表达,可能是其产生遗传毒性的一种机制,建立的方法可以很好地用于全基因组DNA总甲基化水平的检测。 相似文献
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5-氮胞苷(5-aza-CR)及其类似物对HL-60细胞分化及DNA甲基化的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
本文报道了5-aza-CR和5-aza-CdR对HL-60细胞分化及DNA甲基化作用的影响。用NBT染色法测定了加药处理前后HL-60细胞分化程度的变化;用[~3H-SAM]为甲基供体,以同位素参入法测定了加药前后HL-60细胞中甲基化酶活力的变化;并用HPLC法测定了加药前后HL-60细胞DNA的甲基化水平。结果表明:在5-aza-CR或5-aza-CdR的使用浓度下处理HL-60细胞沿粒细胞系分化程度增加,DNA甲基化酶活力下降,DNA甲基化水平也下降。并且这些变化均与5-aza-CR的浓度相关;5-aza-CR的影响较5-aza-CdR小,因此后者是更为有效的诱导物。本项研究中还以不同甲基化水平的HL-60细胞DNA为模板,在体外测定了E.Coli RNA聚合酶的活力。发现:随着HL-60细胞DNA甲基化水平的降低,RNA聚合酶的体外转录活力升高。 相似文献
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利用多重监测反应模式(MRM),通过对液相色谱及质谱条件的优化,建立了人体结肠癌组织样品中基因组DNA甲基化的高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI MS/MS)检测方法,对结肠癌组织及癌旁组织中基因组DNA甲基化进行了检测.结果表明,5-甲基脱氧胞苷(5mdC)的检出限是1 pg,线性范围为0.037 5~0.5 mg/L,工作曲线相关系数大于0.999 0,该方法的相对标准偏差为2.32%~9.21%.结肠癌病人样品检测结果表明,结肠癌组织基因组DNA甲基化水平低于相应的癌旁组织(P<0.05). 相似文献