纳豆激酶液体发酵条件的优化

纳豆激酶是从日本传统食品内豆中提取出来的一种具有溶血栓功能的酶。笔者从市售纳豆中分离出一株能产纳豆激酶的菌株,并对之进行液体培养,发现在ｐＨ７．０,接种量为２％,种龄２４ｈ,装液量１０ｍＬ／１００ｍＬ,碳源为木糖,浓度为２％,氮源为大豆蛋白胨,浓度为３％的条件下,接种后第四天为产酶高峰期,最高产酶量可达到７８７．１尿激酶单位／ｍＬ发酵液。     

纳豆激酶液体发酵条件的优化

采用比浊法连续测定D600 nm值,绘制菌种生长曲线,确定纳豆菌培养条件,并用单因素和正交设计实验的方法对纳豆激酶发酵条件进行优化,确定培养基成分的最优组合为MgSO40.02 g/L,K2HPO40.02 g/L,KH2PO40.01 g/L,CaCl20.02 g/L,麦芽糖0.3 g/mL,大豆蛋白胨0.3 g/mL,最适培养温度是37℃,pH=8.0,最佳接种量为每5 g黄豆接种500μL菌液.用Folin-酚法测酶活,由优化前的31.25 U/mL发酵液提高到158.74 U/mL发酵液,单位产量提高了约5.08倍.通过对纳豆激酶发酵培养条件的初步研究,探索纳豆激酶的生产工艺,为纳豆激酶产业化生产提供理论支持.     

纳豆激酶产生菌的固体发酵参数优化

对影响纳豆激酶产生菌固体发酵时产酶影响因子如碳源/氮源、含水量、温度、pH和培养时间等进行了优化.实验结果表明,菌株1适宜的固体发酵产酶培养基豆粕:麸皮比为3∶1;菌株2适宜的固体发酵产酶培养基豆粕:麸皮比为1∶1时产酶活性最高;菌株1适宜的培养基含水以50%最好,菌株2以70%最好;培养基初始pH均在7.0时酶活最高;发酵温度均以25℃最好,不易超过30℃;两个菌株的适宜发酵时间分别为36 h(菌株1)和72 h(菌株2).在优化发酵条件下,两个菌株单位发酵物中纤溶酶平均酶活力可分别达到1 407.25 U/g(菌株1)和953 U/g(菌株2).     

纳豆菌I液体发酵生产纳豆激酶最佳培养基的筛选

利用纳豆菌I液体发酵生产纳豆激酶。对影响生产纳豆激酶的培养基的成分——碳源、氮源、碳氮比以及4种盐浓度进行了筛选。结果表明:当蔗糖3%,蛋白胨2%,KH2PO40.1%,K2HPO40.25%,MgSO40.05%,CaCl20.01%时纳豆菌I产酶效果最佳。     

纳豆激酶液体混菌发酵工艺研究

用实验室复合诱变选育的5株产纳豆激酶正向突变菌株,通过随机组合混菌发酵试验,确定了混菌发酵产NK活性最高的菌株组合为CBL-2-7-10-6、DNS-17-3-15-7和L-5-8-15.随后经过一系列正交试验和单因素试验,确定了这3个突变菌株混合发酵的最佳发酵工艺:发酵培养基中葡萄糖质量分数为4%、大豆蛋白胨4%,MgSO₄ 0.04%,CaCl₂ 0.06%,K₂HPO₄ 0.2%,KH₂PO₄ 0.1%;CBL-2-7-10-6,DNS-17-3-15-7和L-5-8-15这3个突变株接种量分别为670、670和1000μL/100 mL;初始pH7.0,发酵温度31℃,摇床转速160 r/min,发酵时间50h.在该条件下,发酵NK酶活性可以达到4 952.33 IU/mL,是本研究单菌株发酵最高酶活(DNS-17-3-15-7的NK活性2 096.57 IU/mL)的2.36倍.     

以豆粕为原料固态发酵产纳豆激酶工艺的优化

以食品级豆粕为唯一培养基成分,通过纳豆芽孢杆菌固态发酵产纳豆激酶的培养基的优化实验,确定优化条件为:接种量5％,装量为40g于250 mL锥形瓶,培养基含水量60％,浸泡水pH 7.5,发酵温度37℃.在培养24h后达到产酶高峰,产酶活力达到1 662 FU/g.比较了在相同的发酵条件下,以食品级豆粕为培养基比大豆为培...     

液体发酵高产纳豆激酶菌株的复合诱变选育

从市售豆豉和保藏的固体发酵产纳豆激酶(NK)高活性的菌株中,筛选出5株诱变育种出发菌株.经紫外-亚硝基胍-Co60复合诱变后,获得5株液体发酵产NK高活性的菌株LJJ-1-13-12-4、PXDBJ-13-9-7-18、DNS-17-3-15-7、CBL-2-7-10-6和L-5-8-15,其产NK活性,分别为1 846.15、1 956.48、2 184.32、1 865.38和2 095.23 U/mL,分别是诱变前出发菌株的1.62、1.81、1.98、1.61和1.62倍.高产纳豆激酶菌株的选育为纳豆激酶液体发酵的进一步工业化奠定了良好的基础.     

PCR扩增纳豆激酶基因的程序优化

研究了利用ＰＣＲ从纳豆菌基因组ＤＮＡ中扩增纳豆激酶基因的最优化条件，得到ＰＣＲ反应在本研究中的最重要的三个参数值为：模板量１０ｎｇ；Ｍｇ＾２＋浓度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ；退火温度６０℃。在这种优化程序下进行ＰＣＲ反应，获得了特异、高效和忠实的纳豆激酶基因产物。     

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.     

营养条件对菌株N1产纳豆激酶的影响

分析了影响N1菌株产纳豆激酶的营养条件,结果表明,半乳糖和酵母膏为最佳碳源和最佳氮源. 据此,采用响应曲面法,优化了营养条件,由回归方程,找出了适合菌株 N1 生长的最佳配方——半乳糖 12.51g/L、酵母膏 4.82 g/L、磷酸二氢钾 1.67 g/L、硫酸镁 0.76 g/L,此时纳豆激酶酶活理论值为 179.08 U/mL.     

纳豆杆菌纳豆激酶成熟肽基因的克隆与同源性分析

纳豆杆菌 (Bacillusnatto)是从日本传统食品纳豆中筛选出来的 ,它具有较强的溶栓作用 .根据已发表的纳豆激酶基因序列设计一对引物 ,利用聚合酶链式反应 (PCR) ,从纳豆杆菌的基因组DNA中扩增和克隆到纳豆激酶基因 .序列分析表明 ,该纳豆激酶基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献已报道的序列分别有 93.4 %和 94 .5 %的同源性 ,显示了极高的同源性 .但该基因与该室克隆的豆豉溶栓酶基因的同源性仅为 80 .1%,这表明纳豆激酶与豆豉溶栓酶确实不是同一种酶 .     

纳豆激酶纯化及性质研究

以蒸煮后的大豆为原料通过纳豆菌发酵,生产纳豆激酶.改进纯化工艺以酸法提取和凝胶过滤纯化出比活性为160.8IU/mg的酶制品.该酶制品不仅对纤维蛋白有很好的溶纤作用,而且对大鼠血纤维（拟血栓）也有很好的溶纤活性,实验还证明该酶制品对大鼠新鲜血液有很好的抗凝性能,尤其是该酶制品在pH值为2.45和经胃蛋白酶作用后仍保持较高的活力.同时,该方法制备工艺简便,有0.6%的高回收率,故本方法提取的纳豆激酶制品有望开发成为新型口服溶栓、防栓制剂,以供医疗和保健应用.     

纳豆激酶原基因的克隆及表达

从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因，与质粒PBV220连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定得到一条约1000bp的条带。阳性克隆经温度诱导表达，用SDS－PAGE电泳鉴定，在38kD处有一条明显的带，占菌体蛋白的20％左右，同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在。包涵体经收集、蛋白变性及复性后显示溶血栓活性。     

纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究

以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增了纳豆激酶基因（natto kinase gene）中编码前肽、成熟肽的核苷酸序列（pro-NK），构建大肠杆菌表达质粒pTYB102，转化大肠杆菌ER2566。在IPTG诱导下，分别在15℃（14h）、30℃（3h）、37℃（2h）条件下培养，pTYB102均能表达出有活性的纳豆激酶。实验证实纳豆激酶基因得到活性表达需要Pro序列。SDS－PAGE表明，15℃和30℃和37℃培养表达的杂蛋白更少。薄层扫描测定表达的纳豆激酶占菌体总蛋白30％以上。     

豆豉生产中高大毛霉和纳豆芽孢杆菌 HT8 共发酵条件研究

通过实验室人工模拟条件，把豆豉感官、生长和纳豆激酶活性作为评判标准，首先采用单因素实验探索了豆豉生产中高大毛霉和纳豆芽孢杆菌 HT8 共发酵的接种量、菌种比例、接种时间和发酵温度 4 个单因素的最佳条件，然后通过正交实验探索了这 4 个因素的联合最佳条件。结果表明，高大毛霉和纳豆芽孢杆菌共发酵的最佳接种量为 4%，菌种比例为10:1，培养温度为25 ℃，发酵时间为56 h；在此条件下毛霉生长繁茂，豉香浓郁，且纳豆激酶活力达1 092.71IU mL-1。高大毛霉和纳豆芽孢杆菌 HT8 混合发酵在保持豆豉原有风味的同时丰富了发酵产生的蛋白酶系，使之具有纳豆激酶活性，为新型保健食品的开发提供了新思路。
     

纳豆激酶酶学性质研究

通过测定纳豆激酶对4种人工合成底物的水解活性,以及SDS-PAGE电泳分析等,比较了两株高产纳豆激酶菌株发酵产生的纳豆激酶的酶学性质.结果发现两菌株产生的纳豆激酶的最适底物均为N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA;两菌株产生的纳豆激酶对牛纤维蛋白原的水解过程基本一致,反应不同时间,对牛纤维蛋白原不同分子质量的亚基的水解速度不同,9 h后,牛纤维蛋白原基本被全部水解.这为纳豆激酶的进一步研究奠定了基础.     

纳豆激酶的高效表达研究进展

心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)已成为影响人类健康的主要疾病.纳豆激酶(nattokinase,简称NK)是一种由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分泌表达的碱性丝氨酸蛋白酶,具有较强的溶栓活性.文章主要就NK溶栓机理、高效表达方面进行论述,简要概述近年来NK高效表达研究进展,并对未来NK发展趋势进行展望.     

纳豆激酶酶学性质的初步研究

通过(NH4)2SO4对NK分级盐析浓缩,发现用饱和度为65%的(NH4)2SO4盐析,浓缩10倍,NK回收率最高,可达到87.1%.对其纤溶活性研究表明,NK在40℃以下时,纤溶活性相对稳定,65℃以上时,活性迅速下降;pH<4时,显著抑制NK活性;Mg2+对其纤溶活性有显著激活作用,Zn2+,Ca2+,Fe2+和Cu2+对NK有不同的抑制作用,而Al3+则使NK活性完全丧失.     

纳豆激酶基因导入番茄的研究

将来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶(nattokinase,NK)基因转化到人类可以直接食用的,又非常喜爱的蔬菜—番茄中,得到在转录水平表达的转基因植株.通过根癌农杆菌EHA105介导,转化番茄的下胚轴,诱导愈伤组织形成及分化成幼苗,进而再生出完整植株.提取再生植株基因组DNA,通过PCR扩增检测,结果表明纳豆激酶基因已经成功整合到番茄植物基因组中.RT-PCR实验结果证明了纳豆激酶基因在转录水平上有表达.     

高效溶栓菌株的筛选鉴定及发酵条件优化

采用酪蛋白平板法,从纳豆激酶胶囊、纳豆及多种发酵食品中筛选出了146株产溶栓酶菌株;然后利用纤维蛋白平板法比较发酵后溶栓酶活力,并从初筛菌株中筛选出1株溶栓酶活达1 637.6 IU/mL的高产菌株HT8;依据菌种形态和生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).在此基础上,对此高效溶栓菌株的液体培养条件进行了单因素初步实验,方差分析后设计正交试验L18(37),通过软件SPSS分析确定该菌最佳发酵条件为初始pH值8.0、温度40 ℃、培养体积90 mL(容量为500 mL的三角瓶装90 mL的培养液)、0.5％牛肉膏和2％大豆蛋白胨;优化后的相对酶活力达1 804.08 IU/mL.研究结果为进一步开发纳豆等保健食品提供理论基础.