小拟南芥双键还原酶基因OpDBR的克隆及表达分析

从小拟南芥,又名无苞芥(Olimarabidopsis pumila,异种名Arabidopsis pumila)幼苗叶片c DNA文库中获得1条与拟南芥烯醛双键还原酶基因At DBR1(Gen Bank登录号为NP_197202.2)高度相似的EST序列,该序列包含1个1041 bp的最大开放阅读框(ORF),推测编码346个氨基酸(Gen Bank登录号为KU845686)。利用RT-PCR技术从小拟南芥叶片的c DNA中克隆了该基因,命名为Op DBR。比对分析结果表明,该基因属于中链还原/脱氢酶(medium chain reductase/dehydrogenases,MDR)超级家族,具有double bond reductase-like保守蛋白结构域;该蛋白的二级结构包含106个α-螺旋和48个β-转角。系统进化树分析结果表明,Op DBR编码产物与预测的亚麻芥烯醛双键还原酶(Gen Bank登录号为XP_010492631.1)遗传关系最为接近,属于同一进化分支。实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)结果显示,Op DBR在小拟南芥的不同组织中都有表达,茎中表达量最高,根中最低。其在200 mmol/L Na Cl、4℃、100μmol/L ABA、20%PEG-6000处理下的表达结果分析显示,该基因可能在小拟南芥应对逆境胁迫时起着重要作用。     

棉纤维醛酮还原酶基因促进拟南芥主根伸长

为了研究棉纤维醛酮还原酶基因在参与细胞伸长发育中所起的作用,本研究利用RT-PCR技术从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克隆得到棉花醛酮还原酶(aldo/keto reductase,AKR)基因c DNA,该基因全长读码框为1134 bp,编码377个氨基酸。氨基酸序列生物信息学分析表明Gh AKR蛋白具有较高的保守性,包含氧化还原酶、醛酮还原酶结合位点和跨膜信号序列等功能序列和位点;进化树分析显示Gh AKR与可可(Tc AKR)的亲缘关系较近。q RT-PCR和酶活性分析表明Gh AKR基因与纤维细胞的快速伸长发育密切相关,尤其在开花后5-15 d纤维快速伸长发育时期具有较高的表达。构建35S::Gh AKR过量表达载体并转化野生型拟南芥(哥伦比亚生态型),转基因拟南芥的主根伸长发育获得了显著的促进,与野生型相比,转基因拟南芥主根伸长增加了约1.4倍。拟南芥根中甲醇和乙醇含量分析显示,转基因拟南芥根中具有较高的甲醇和乙醇积累。这些结果表明棉纤维Gh AKR基因与纤维细胞伸长发育联系紧密,可能通过增加细胞内的醇含量进一步促进细胞的伸长。本研究可为棉花Gh GAKR基因参与纤维伸长发育分子机制解析,以及利用基因工程培育优质棉花品种提供一定参考。     

油菜BnRCH基因提高转基因拟南芥的耐盐性研究

为探索本实验室从甘蓝型油菜中克隆到的BnRCH基因在植物耐盐中的作用,比较了NaCl胁迫下转基因与野生型拟南芥在萌发及幼苗生长的差异.结果表明:在100 mMNaCl处理下,BnRCH转基因拟南芥种子萌发率比野生型高3～5倍;盐胁迫后野生型拟南芥幼苗首先表现出枯萎、白化现象;除去盐胁迫后,转基因拟南芥幼苗恢复生长状况明显优于野生型.本实验结果表明BnRCH基因能够提高转基因拟南芥的耐盐性.     

新疆小拟南芥ApCBF1基因的克隆及其过量表达转基因的研究

利用同源克隆法,克隆了小拟南芥的CBF1基因的cDNA（FJ491244）,比对分析结果表明,ApCBF1的cDNA序列的A252,在拟南芥的AtCBF1的cDNA是T252,但翻译的氨基酸均是Ala,表明ApCBF1和AtCBF1翻译的氨基酸序列完全一致。构建了过量表达载体：p35S：ApCBF1,通过花滴法转入小拟南芥中。RT-PCR检测结果表明,转基因T0代AtCBF1基因过量表达。     

小拟南芥ApCBF基因的克隆及转化烟草的初步研究

CBF是植物冷驯化过程中的关键性调节因子。利用PCR及染色体步移法从新疆特有拟南芥近源种植物——小拟南芥的基因组中克隆了CBF基因的同源序列（DQ207404）。生物信息分析表明,该序列具有完整的读码框,推定的蛋白质序列与拟南芥CBF1,2,3的相似性分别为：87．6％、86．6％和88．1％。以植物表达载体pBI121为基础,构建了由组成型启动子35S调控ApCBF的植物表达载体pCB111。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR检测初步证明却ApCBF基因已整合到烟草基因组中。为利用ApCBF基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。     

高山离子芥CbPLDβ基因对转基因烟草抗寒性的影响

为分析高山离子芥CbPLDβ基因的抗寒性价值,本实验构建了高山离子芥CbPLDβ的表达载体PBI121-CbPLDβ并转化烟草,经过筛选及PCR测序鉴定,获得转基因烟草植株.通过低温胁迫实验,分析了转基因烟草的抗寒性,结果表明:外源基因已经整合到烟草基因组中,在低温胁迫下转基因烟草植株的电解质渗透率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均高于野生型烟草,说明CbPLDβ基因提高了烟草抵抗低温的能力.     

拟南芥DnaJ蛋白的过量表达对细菌耐盐性的影响

热激蛋白是植物在各种环境胁迫下产生的一种蛋白,其表达与多种胁迫的抗性有一定关系。从野生型拟南芥cDNA中克隆获得了编码442个氨基酸序列的DnaJ基因,其与大肠杆菌DnaJ基因含有相同的J区和半胱氨酸富集区。将DnaJ基因构建到pET32a的原核表达载体,过量表达DnaJ基因的细菌在含有0.5 mol/LNaCl的培养基中仍然可以生长,初步推断DnaJ的表达与耐盐性有关。     

柠檬醛诱导的拟南芥抗旱性及差异表达基因分析

本研究旨在探讨柠檬醛在植物抗旱方面的潜在应用价值.以不同浓度的柠檬醛处理拟南芥,我们发现200μmol/L柠檬醛处理的拟南芥在随后干旱胁迫下的存活率高达80%,而未经柠檬醛处理的对照组只有40%左右.转录组测序(RNA-seq)分析发现经200μmol/L柠檬醛处理后有230个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),DEGs在GO功能注释和KEGG通路中分别显著富集为应激反应和内质网中的蛋白质加工,且上调表达的DEGs许多都与热激蛋白家族相关.从中挑选4个(AT1G07400,AT2G26150,AT4G25200,AT4G12400)进行RT-qPCR验证,发现其反映的表达水平和RNA-seq数据一致.本研究表明200μmol/L柠檬醛处理可以诱导拟南芥产生抗旱性,并可能通过热激蛋白使干旱胁迫后部分解折叠的功能蛋白恢复生理活性状态,从而使拟南芥显示出对干旱更强的耐受性和抵抗力.     

丹参酮类化合物对醛糖还原酶抑制作用的研究

从西藏灵芝丹参的脂溶性提取物中分离出了12个丹参酮类化合物,并对这些化合物对牛晶状体醛糖还原酶的抑制作用进行了研究,结果表明丹参酮类化合物对醛糖还原酶均具有较强的抑制作用,其中带有半醌结构的丹参酮类化合物化合物S6、S7、S8、及S9对醛糖还原酶的抑制作用活性最强,IC50值分别为32.9μmol/L、36.5μmol/L、34.9μmol/L和39.6μmol/L。     

表达千穗谷Ah-AMP基因的转基因烟草抗病性研究

通过PCR从苋属植物千穗谷(Amarathus hypochondriacus)的总DNA中扩增出苋菜抗菌肽(Ah-AMP)的核基因片段,序列分析结果表明该基因长261bp,编码一个由86个氨基酸组成的Ah-AMP前体多肽.在构建Ah-AMP基因的植物表达载体pBinAH916后,通过根癌土壤杆菌介导方法转化了烟草.转化再生植株和T 1 代转基因烟草的PCR和Southern blot分析表明,Ah-AMP基因已整合到烟草的染色体中,并为单拷贝整合.T 1 代转基因烟草的Northern blot分析结果表明,Ah-AMP基因在转基因烟草中至少在mRNA水平上能正常表达.对T 0 代转基因烟草进行烟草青枯病的抗病性试验,筛选出两株抗性较强的植株.对T 1 代抗青枯病的统计分析发现,其抗病性比起始品种SR1分别提高了2.24和1.62个级别;其病情指数比起始品种降低49.6%和37.3%.对黑胫病也表现一定的抗性,主要表现在推迟发病时间,减缓发病速度上.这些结果表明Ah-AMP基因在植物抗病基因工程研究中可能是一个有潜在应用价值的基因.     

NtAN9基因的RNAi改变转基因烟草花色

植物谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase,GST)与花青素苷的转运和积累有关。为验证烟草中编码GST的NtAN9基因的功能是否与此相关,构建了一个NtAN9基因的含内含子的发夹干涉载体pRNAi-NtAN9,并用农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草中,获得了转基因阳性植株。对转基因烟草盛花期(阶段IV)花的花青素苷含量测定和内源NtAN9基因的qRT-PCR分析,结果表明内源NtAN9基因的表达受到RNAi的抑制,表达水平大量下降,导致花青素苷的积累受阻含量大幅降低,花色由粉红变为白色。上述研究结果表明NtAN9基因的功能与花的呈色密切相关,为进一步研究烟草花青素苷的转运和积累奠定了基础。     

转基因烟草中过量生长素对叶片生长发育的影响

分别构建了ｉａａＭ、ｉａａＭ 和ｉｐｔ共表达植物转化载体,农杆菌介导转化烟草,ＲＴ－ＰＣＲ鉴定转基因株系,ＥＬＩＳＡ方法分析叶片ＩＡＡ、ＩＰＡ 和ＺＲ含量．结果表明:叶片ＩＡＡ 含量高低依次为株系ｉａａＭ１０、ｉａａＭ＿ｉｐｔ３和野生型;而细胞分裂素含量高低依次为ｉａａＭ＿ｉｐｔ３、野生型和ｉａａＭ１０．随着内源ＩＡＡ 水平升高,气孔密度 减 小、保卫细胞长度增加、栅 栏 组 织细胞增大和叶片厚度增加．讨论了生长素和细胞分裂素含量对叶片细胞生长发育的影响．      

转基因烟草中过量生长素对叶片生长发育的影响

分别构建了iaaM、iaaM和ipt共表达植物转化载体,农杆菌介导转化烟草,RT-PCR鉴定转基因株系,ELISA方法分析叶片IAA、IPA和ZR含量.结果表明:叶片IAA含量高低依次为株系iaaM10、iaaM_ipt3和野生型;而细胞分裂素含量高低依次为iaaM_ipt3、野生型和iaaM10.随着内源IAA水平升高,气孔密度减小、保卫细胞长度增加、栅栏组织细胞增大和叶片厚度增加.讨论了生长素和细胞分裂素含量对叶片细胞生长发育的影响.     

拟南芥抗旱相关基因的表达载体构建及转基因植株鉴定

文章以拟南芥Col-0植株的基因组DNA和cDNA为模板扩增出LWT2基因全长和CDS片段,用pEASY-Blunt Zero Cloning Kit试剂盒连接至中间载体,转化到Trans1-T1感受态细胞内,通过单克隆挑选、菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定及质粒测序验证获得DNA阳性克隆。利用限制性内切酶双酶切获得含有黏性末端的目的片段和载体片段,进行DNA连接反应可得最终的互补和过表达构建。提取质粒DNA测序确认后将2个构建分别转化至农杆菌菌株GV3101,菌落PCR鉴定后通过浸花转化法转化拟南芥lwt2-1突变体植株,最后通过转基因筛选与遗传鉴定获得相应构建的转基因阳性植株。     

拟南芥开花基因FT对根毛生长的影响研究

为进一步研究成花素(FLOWERING LOCUS T,FT)基因对植物营养生长的影响,通过结合qRT-PCR和生理学实验的方式对FT过表达及突变体植株进行比对分析.研究发现,FT过表达植株与野生型相比,其根毛短且稀疏,且具有分叉型、膨大型、波浪型等极性生长缺陷表型;相反,突变体ft-10的根毛相对长且密集,略优于野生型,无极性生长缺陷表型.通过实时定量PCR分析与根毛起始伸长过程相关基因KOAJK、SCN1、RHD2、LRL3、RSL4、RHD6的表达量,FT过表达植株显著低于野生型,而突变体ft-10略高于野生型.结果表明,FT基因在根毛起始伸长过程中起负调控作用,影响根毛的极性生长及数量分布.本研究增加了对FT基因在营养生长过程中功能的认识,同时也为深入研究根系发育的分子机理奠定了基础.     

葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在转基因烟草中的表达

通过PCR扩增,克隆了黑曲霉编码葡萄糖氧化酶的GO基因.构建了CaMV35S启动子驱动的GO基因植物表达载体,经农杆菌介导的遗传转化,获得了转基因烟草植株.经Southern,Northern和Western杂交分析,证明了GO基因在转基因烟草中的整合、转录和翻译.转基因烟草中H2O2的含量最高可达610μmol/L,比对照提高近5倍.嫁接试验证实H2O2可由砧木远距离运输至接穗,但不能由接穗转运至砧木,说明H2O2是通过导管由下向上运输.非转基因接穗嫁接至转基因砧木上3周,接穗上不同节位叶片中H2O2的含量不存在浓度梯度,说明这是一种主动运输而不是被动扩散.     

拟南芥CGP1基因启动子克隆及其GUS转基因植株的构建

前期研究发现一个功能未知基因响应植物镉胁迫,将之命名为CGP1。文章为探究植物基因CGP1的表达模式及其在响应镉胁迫中的表达变化情况,以野生型拟南芥为实验材料构建CGP1基因启动子接pART7-GUS载体及其转基因植株。通过提取野生型拟南芥的DNA,并以DNA为模板利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术克隆得到CGP1基因启动子序列,将启动子序列和GUS载体双酶切后进行连接,并转化到大肠杆菌感受态细胞中,通过测序获得构建成功的ProCGP1-GUS载体。利用浸染花序法将ProCGP1-GUS载体转入野生型拟南芥中,并通过抗性筛选获得ProCGP1-GUS转基因阳性植株,为研究镉胁迫下CGP1基因的功能奠定了基础。     

NaCl对拟南芥VHA-c基因的调节

将烟草叶片以不同浓度的NaCl溶液处理下,研究转三磷酸腺苷酶(V-ATPase c)亚基基因(VHA-c)的β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因表达水平的变化。结果表明,V-ATPase c2亚基基因(VHA-c2)和V-ATPase c3亚基基因(VHA-c3)的表达活性有所降低,V-ATPase c5亚基基因(VHA-c5)的表达被50 mmol/L的NaCl促进,被200 mmol/L的NaCl抑制,说明VHA-c2、VHA-c3和VHA-c5均可被NaCl溶液调控,且VHA-c2的表达不存在与NaCl溶液浓度的协同关系,VHA-c3和VHA-c5对较低浓度的NaCl溶液胁迫更为敏感,对高浓度的NaCl处理并不敏感。     

小拟南芥转运蛋白基因及NHX2基因的克隆与表达

转运蛋白(transport protein)是膜蛋白的一大类,介导生物膜内外的化学物质及信号的交换。植物体内存在多个与Na~+转运相关的蛋白,其中液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白(Vacuolar Na~+/H~+antiporter,NHX)在离子稳态和提高植物耐盐性方面发挥着重要作用。为了深入了解转运蛋白基因在短命植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)耐盐方面的作用,本研究首先基于小拟南芥响应高盐胁迫叶片转录组数据筛选出1157个转运蛋白基因,按功能分为Na~+转运蛋白,K~+转运蛋白,Ca~(2+)转运蛋白,ABC转运蛋白以及糖转运蛋白等,其中功能注释为Na~+转运蛋白的基因有24个。K均值(K-means)聚类分析结果显示,1157个转运蛋白基因分布于20个K subcluster,其中在K6、K9、K15子聚类中的基因数量分布较多,分别为172、193、190个。在分布于K6子聚类的Na~+转运蛋白基因中,有一个编码NHX2蛋白的基因经盐胁迫处理后明显上调表达。采用RT-PCR克隆了Ap NHX2基因,Ap NHX2开放阅读框1626 bp,编码541个氨基酸。Ap NHX2蛋白是一个典型的跨膜转运蛋白,具有12个跨膜结构区。系统进化分析表明Ap NHX2与拟南芥At NHX2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,Ap NHX2基因在小拟南芥各组织中均有表达,但在花中表达量最高。为进一步研究该基因的功能,构建了过量表达载体35S∶Ap NHX2并转化农杆菌GV3101。本研究为进一步阐述转运蛋白基因在小拟南芥响应盐胁迫中的功能机制奠定了基础。     

拟南芥CAM5基因对愈伤组织形成的影响

愈伤组织形成是植物组织培养的重要阶段.钙调素含量在愈伤组织形成过程中发生变化,但钙调素是否参与愈伤组织形成仍不清楚.为此,本文分析了一个钙调素基因CAM5的组织表达模式,结果发现,CAM5基因在拟南芥植株的根、茎、叶、花及幼苗中均有表达.此外,鉴定了拟南芥CAM5基因的纯合突变体CAM5,并观察其叶柄外植体在愈伤组织诱导过程中的表型,结果发现,在愈伤诱导培养基中培养20d,与野生型相比,突变体的叶柄外植体膨大比较明显.进一步分析显示,培养20d后,突变体外植体的鲜重比培养前增加了39倍,而野生型仅增加了16倍.这些结果暗示犆犃犕5基因参与了愈伤组织形成.