一个新的凋亡抑制蛋白P49的表达及氨基酸序列分析

从海灰翅夜蛾核型多角体病毒（SpliNPV)中新发现的p49基因可抑制病毒感染引起的草地贪夜蛾细胞Sf9的凋亡，用杆状病毒表达系统Bac to Bac克隆表达并收获P49蛋白，发现所测定的表达蛋白的氨基酸序列与由核苷酸推导的氨基酸序列一致，证明p49基因经克隆转染后得到正确表达，P49蛋白上－^91TVTDG^95－氨基酸序列为Caspase识别结构，比较P35与P49蛋白，两蛋白同源性约为48．8％，且都具Caspase识别和切割的氨基酸序列。     

用宿主范围扩大的重组AcNPV在家蚕中表达TNF

用宿主范围扩大的核型多角体病毒双穿梭载体Bonpvid与重组转座质粒 pFast-TNF转座，使含有有TNF基因的表达盒插入Bonpvid的Tn7att的接受位点筛选阳性重组E.coli菌落，将提取的阳性重组子DNA分别转染家蚕BmN细胞和Sf-9细胞，获得了能表达TNF的重组病毒，SDS－PAGE和Western blot分析表明，TNF在上述两种细胞中得到表达，以家蚕作为生物反应器，将含有重组病毒的的细胞上清注射感染家蚕4龄幼虫，使TNF在蚕体表达，用BmN细胞中表达的TNF感梁肿瘤细胞，诱导细胞发生了凋亡。     

棉铃虫核型多角体病毒朝鲜分离株BamHI-Ⅰ片段的核苷酸序列分析

对在朝鲜首次分离得到的棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株(HaSNPV-KO)基因组BamHI-Ⅰ片段的全序列进行了测序与分析．该片段全长1．895kb．包括p26基因．p10基因及p74基因的3′末端序列．p26基因位于户10基因的上游．排列方向与p10基因相同，该基因的编码区大小为803bp，编码267个氨基酸，p10基因的编码区大小为261bp，编码87个氨基酸．p74基因的排列方向与p10和p26基因相反．棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株与棉铃虫核型多角体病毒中国株(HaSNPV-g4株)的p26基因序列的同源性为99．8％，两个分离株的p10基因序列完全相同，而p74基因3′末端序列的结果有99．4％的同源性．朝鲜株与美洲株(HzSNPV)的p26和p10基因序列的同源性分别为98．8％，98．7％，而p74基因3′末端序列有97．9％的同源性．     

一个新的杆状病毒凋亡抑制基因的克隆及鉴定

缺失功能性ｐ３５基因的苜蓿尺蠖核形多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）突变体（ｖΔＰ３５Ｋ／ｐｏｌ＋）感染草地夜蛾细胞（Ｓｆ９和Ｓｆ２１）［１］及海灰翅夜蛾细胞（ＳＬ２）［２］时，引起细胞凋亡，从而使病毒的感染流产．我们发现海灰翅夜蛾核形多角体病毒（ＳｌＮＰＶ）...     

HaNPV穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达

ＨａＮＰＶ穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达＊朱应齐义鹏＊＊刘德立（武汉大学病毒研究所，武汉４３００７２）关键词棉铃虫核型多角体病毒，穿梭载体，绿色荧光蛋白基因分类号Ｑ７８，Ｓ８５２．６５杆状病毒表达载体被广泛用于表达各种外源基因．由于...     

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒的增殖 ,纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒 提纯的病毒粒子经SDS 酚抽提 ,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA ,低熔点琼脂糖电泳法回收纯化编码多角体蛋白的第十片段S10 S10经DMSO变性 ,逆转录合成cDNA第一条链 ,PCR扩增后 ,克隆在PMD18 T载体上 ,克隆片段全长 76 3bp 起始密码AUG位于第 3～ 5位碱基 ,终止密码UGA位于第 74 7～ 74 9位碱基 推测DpwCPV多角体蛋白基因编码一段由 2 4 9个氨基酸组成的多肽 ,分子质量为 2 84 39.4 4× 10 3 与舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)多角体蛋白基因比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 97% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 99% ;与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)多角体蛋白基因相比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 88% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 97%     

人脊髓灰质炎病毒感染诱发Vero细胞凋亡的研究

用人脊髓灰质炎病毒分别感染Ｖｅｒｏ细胞和稳定表达ｐ３５基因的Ｖｅｒｏ３５细胞，经细胞核ＤＡＰＩ染色，细胞ＤＮＡ琼脂糖电泳和ＴＤＴ生物素原位标记等方法证实病毒感染的细胞具有典型的凋亡细胞学特征和生物化学特征．实验结果表明人脊髓灰质炎病毒感染Ｖｅｒｏ细胞诱发的细胞死亡能被昆虫杆状病毒凋亡抑制基因ｐ３５抑制，为ＩＣＥ类蛋白水解酶途径的细胞凋亡．     

重组家蚕核多角体病毒（rBmNPV）的复制及所载HuIFN－α基因的表达

报道了重组家蚕核多角体病毒（ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｎｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓＢｍＮＰＶ）在家蚕细胞ＢｍＮ中复制的细胞病理学变化，除了不形成多角体以外，与野生型病毒相同．研究了病毒感染复数、细胞接种密度和细胞生长阶段对重组病毒复制和α－干扰素（ＩＦＮ－α）表达量的影响．在一定低感染复数时，α－干扰素的产量较高．对于重组病毒的复制，最适的细胞接种密度为３．６～７．０×１０５细胞／瓶．在细胞指数生长前期（４８～６０ｈ）接种重组病毒，对于获得较高的重组病毒复制效价和α－干扰素的产量都是有利的．     

杆状病毒p35基因延缓昆虫细胞凋亡

构建了以新霉素抗性基因为筛选标记的带有ｐ３５基因的转移载体ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ，以此载体转染Ｓｆ９细胞，经Ｇ４１８筛选得到染色体上稳定整合质粒ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ的Ｓｆ９细胞，克隆化培养后取名为Ｓｆ９－３５．经细胞原位杂交实验证明，Ｓｆ９－３５细胞的染色体ＤＮＡ上含有ｐ３５基因；经放线菌素Ｄ处理后的细胞核酸电泳检测，证实Ｓｆ９－３５具有抗凋亡特性能够支持凋亡抑制基因缺失的ｖＡｃΔｐ３５病毒复制；发现ｐ３５基因在细胞内组成型表达只能延缓ｖＡｃΔｐ３５感染及放线菌素Ｄ处理诱发的细胞凋亡的过程，而不能完全阻止其诱发的细胞凋亡．     

复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒P△GP的构建及转染小肠癌细胞的研究

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSVl3的基础上，缺失突变gag和pol基因，并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR，构建辅助质粒p△GP．将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-EGFP和辅助质粒pAGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系，荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI-EGFP和p△GP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白，转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白，而转染有辅助载体p△GP的HIC细胞不表达绿色荧光。结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功，表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性，并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子。     

凋亡抑制基因P35对杆状病毒增殖的影响

以野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacali for nica Nuclear Polyhedrosis Virus,Ac     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌—杆状病毒穿梭系统（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）将一套含有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐＳ６５Ｔ）和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地形成多角体,并在紫外光照射下产生强烈的绿色荧光,以重组病毒感染粉纹夜蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）幼虫后,在阳光下即可看到发射绿色荧光的幼虫,在手提式长波紫外光照射下绿色荧光更为强烈,带绿色荧光的幼虫在昆虫生态学和杆状病毒流行病学等研究领域有广泛的用途     

丙型肝炎病毒NS5B基因在昆虫细胞中的表达

将含有丙型肝炎病毒（HCV）NS5B基因的转移载体pBlueBac5B与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染Sf9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5B基因的重组病毒AcNS5B.提取重组病毒基因组DNA进行Southern分析,发现有一条1.8kb的DNA片段与标记的探针发生杂交.AcNS5B感染Sf9细胞后,在细胞中表达了分子量为66×103的蛋白,用Westernblot方法检查这种蛋白质,能与兔抗HCVNS5B抗血清发生特异的强烈反应.     

稳定表达egfp基因细胞的构建与克隆

将增强的绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent pprotein,EGFP）基因插在HCMV（humancytomegolovirus）启动子下游,构建了表达质粒pCA13-eG,用脂质体Lipofectin介导分别转染HeLa细胞、Vero细胞,仅通过细胞传代,就最能稳定高效表达EGFP的绿色细胞,比较发现,质粒pCS13-eG转染后,产生能高效表达EGFP的HeLa细胞其比率高于Vero细胞;EGFP高效表达对Vero细胞的毒性大于对HeLa细胞的毒性,本研究表明,绿色细胞轮廓清晰,由于其特有的性质,在用于细胞的形态观察、细胞分裂等研究时会有所作为。     

家蚕核多角体病毒双穿梭载体的构建及GFP和HBeAg融合蛋白的表达

用ＡｃＮＰＶ穿梭载体Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,通过同源重组得到整合了ｌａｃＺ／Ｔｎ７ａｔ／ｍｉｎｉＦ表达盒的ＢｍＮＰＶＢａｃｍｉｄ,除能在大肠杆菌／ＢｍＮ细胞中穿梭复制外,还能感染ＢｍＮ－ＰＶ的非允许细胞Ｓｆ９,成功地构建了ＢｍＮＰＶ的双穿梭载体．经与重组转座质粒ｐＦＧＨｅ转座,获得了插入ｇｆｐ／ＨＢＶｅ融合基因的重组ｒＢｍ－Ｂａｃｍｉｄ（ｒＢｍＧＨｅ）,在家蚕细胞中表达了既能发射绿色荧光又具有ＨＢｅＡｇ抗原性的双功能融合蛋白．Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ为杆状病毒ＢａｃｔｏＢａｃ策略增添了一个新成员     

重组真核表达载体pEGFP—C1／cecropin—XJ的构建及其在胃癌细胞MGC80—3中的表达

目的构建新疆家蚕抗菌肽（cecropin—XJ）基因的真核表达载体pEGFP—C1／cecropin—XJ（pEGFP—cec），检测其在肿瘤细胞中的表达情况，探讨抗菌肽对肿瘤细胞的作用机制和抗菌肽抑瘤作用效果．方法应用基因重组技术，将新疆家蚕抗菌肽（cecropin—XJ）基因克隆到真核表达载体pEGFP—C1，通过酶切和测序的方法鉴定重组质粒pEGFP—cec的正确性．将pEGFP—cec经脂质体法转染到胃癌细胞MGc80—3，48h后观察EGFP瞬时表达情况；72h后，应用RT—PCR，检测抗菌肽cecropin—XJ基因的表达；96h后，消化细胞，经台盼蓝染色，检测重组质粒pEGFP—cec表达产物对肿瘤细胞的影响．结果细胞转染48h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达，发出绿色荧光；转染72h后，RT—PCR检测到胞内有抗菌肽cecropin—XJ基因的表达；表达产物能够抑制肿瘤细胞的生长．结论成功构建了真核表达载体pEGFP—cec，并在肿瘤细胞中可见抗菌肽cecropin—XJ和EGFP基因的有效表达以及表达产物具有显著的抗肿瘤活性．为深入开展抗菌肽抑制肿瘤的研究奠定基础．     

穿心莲内酯诱导胃癌细胞周期抑制和内源性凋亡

研究了穿心莲内酯诱导胃癌细胞SGC-7901生长抑制、周期阻滞与细胞凋亡的作用机制.用梯度浓度的穿心莲内酯作用于SGC-7901细胞,以MTT法检测药物对细胞的生长抑制情况;以流式细胞技术检测SGC-7901的周期分布状况、胞内的ROS水平以及线粒体膜电位的变化;以Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡的水平;以Western blot检测不同加药浓度处理后的细胞内相关蛋白水平的变化.可知穿心莲内酯对SGC-7901细胞具有时间依赖和浓度依赖的抑制效果,48h的IC50约为24μg·mL-1;并且能够有效抑制G2/M期的周期进展,随后诱发内源性凋亡途径;与此同时,细胞内的ROS水平上升,线粒体膜电位下降;再加入NADPH之后,细胞内的GSH水平有所回升,周期阻滞得到缓解.细胞内的p53、p-CDC2、cleaved caspase-3/9、Bax等上调;bcl-2等水平下调.穿心莲内酯是通过上调胞内ROS水平并使线粒体膜电位崩溃而诱发G2/M期的周期阻滞与内源性凋亡,最终抑制SGC-7901细胞的生长.     

新城疫病毒HB 92株M基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增了新城疫病毒(NDV)无毒耐热株(HB92株)M基因，将其克隆于pGEM-T载体，并进行了序列测定和分析．结果显示，测定的M基因长1223个核苷酸。包含一个1095个核苷酸的开放阅读框(ORF)，编码364个氨基酸．与已报道的10株NDVM基因比较，核苷酸同源性为88．4％～95．8％，氨基酸同源性为89．8％～95．3％。HB92株与V4株M基因核苷酸的同源性最高(达95．8％)．NDVM蛋白分子中有9对碱性氨基酸。在多肽的第117～120位有一个含4个氨基酸CKKS的特征性结构．这些结果为揭示NDV HB92株的分子生物学背景，了解NDV的分子进化和遗传变异机理，进而开发利用HB92株奠定了基础，也为将NDV另列为副粘病毒亚科的一个新属提供了理论支持．