Engineered Bacterial Fc Receptors

Five new-type Fc receptor molecules were constructed based on streptococcal protein G (SpG) and staphylococcal protein A (SpA). These protein molecules contain one to six Fc binding domains to immunoglobulins which are structurally different from native SpG or SpA. Their expression levels reached 17-30% of the total bacterial proteins after heat induction in E. colt. Immunodiffusion and ELISA results showed that the engineered protein TG (184 amino acid residues) composed of three SpG C3 domain could bind more broadly and efficiently than the native SpG to the IgGs of human, goat, rabbit, etc. , and its optimal pH for binding became wider (pH5-8) compared with the SpG (pH5) ; and the protein TGA (357AA), fused by protein TG and the A, B, C domains of SpA, displayed both the binding pattern of SpG and SpA.     

Protein G中Fc段结合区的结构分析

通过对用PCR技术从链球菌染色体中扩增出的Protein G中IgG Fc段结合区基因片段(191bP)的序列分析,我们发现其中有一个碱基与国外文献报道不同,由此导致一个氨基酸发生变化,即该结构域内Ala~(19)→Thr~(19),但这一变化并不影响其与IgG Fc段的结合。同时,我们还制备出一定量的由大肠杆菌表达的该活性多肽纯品,用圆二色谱仪测定了其二级结构组成,并用计算机做了进一步的预测分析,还同Protein A中相关结构域进行了比较,提出了Protein G与IgG Fc段相结合的可能机制。     

融合蛋白表达过程中N末端蛋白对下游蛋白正确折叠的影响

将灵芝免疫调节蛋白(LZ-8)与免疫球蛋白G的Fc片段(IgG Fc)进行融合表达,通过Protein A亲和层析结合Superdex 75分子筛层析获得了高纯度LZ8-Fc.凝血活性实验结果表明,LZ-8与Fc融合表达在一定程度上影响了其免疫活性;利用分子动力学和圆二色光谱等技术研究了LZ8-Fc的蛋白折叠及组装方式,发现LZ8-Fc的组装方式与LZ-8相同,但是N末端的LZ-8可能影响下游IgG Fc片段的正确折叠,表明在融合蛋白制备过程中,位于N末端的蛋白对下游蛋白的正确折叠起到重要作用,这为融合蛋白制备技术的优化及应用过程中的稳定提供了重要的理论依据.     

含电子给体乙炔二茂铁化合物的光谱及电化学性质

合成了三种含电子给体乙炔基桥连二茂铁化合物Fc—C≡C—Ph—(p-OMe)(3a),Fc—C≡C—Ph—(p-NMe2)(3b)与Fc—C≡C—Ph—(p-NPh2)(3c),并对其结构、光化学及电化学性质进行了表征.吸收光谱表明,所有化合物在可见光区400-550nm都可归属为Fe(II)→Cp—C≡C—Ph—(p-R)(Cp为环戊二烯基)的金属到配体的电荷跃迁(MLCT)光谱,同时检测到3a与3c氧化态在近红外区(分别位于946与1044nm)可归属为Cp—C≡C—Ph—(p-R)→Fe(III)的配体到金属的电荷跃迁(LMCT).电化学测试结果表明,三种化合物都有稳定的Fc+/Fc可逆氧化还原电位,且3b与3c还出现Ph—NR2的氧化电位.3b对质子表现出光及电化学敏感性,随着质子的加入,其MLCT光谱红移,Fc+/Fc电位正移,而Ph—NR2+/Ph—NR2峰消失.     

肿瘤坏死因子与可溶性受体之间相互作用的动力学研究

采用表面等离子体共振(SPR)技术研究了肿瘤坏死因子(TNF)与其两种受体的胞外部分即可溶性受体(TNF sRI/Fc Chimera和TNF sRII/Fc Chimera)的相互作用的动力学性质。采用两种方式进行研究:在传感片上氨基偶联固定TNF,测定其与溶液中两种可溶性受体相互作用;在传感片上固定Protein A,通过其与嵌合蛋白TNF sRI/Fc Chimera和TNF sRII/Fc Chimera分子上Fc片段的特异性作用,将可溶性受体"捕获"固定在传感片上,再测定受体与溶液中TNF的相互作用。结果表明,两种固定方式测定的动力学参数相吻合,TNF与其可溶性受体的亲和常数KD大于10"9mol/L,远高于一般抗体-抗原间的亲和常数(KD=10"5～10"7mol/L)。     

二茂铁基苯酰腙的d区金属螯合物的合成和表征

二茂铁基苯酰腙与d区金属乙酸盐或氯化物在乙醇中反应,得到了6个新的螯合物,分子式为M(Fcbh)n[Fcbh=Fc—C=N—N=C-C_6H_5,Fc=C_5H_5—FeC_5H_4;M=Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)时,n=3;M=Mn(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)时,n=2]和Pd(Fcbh—H)_2Cl_2[Fcbh—H=Fc—C=N—NHCOC_6H_5]通过元素分析,红外光谱,H核磁共振谱和质谱,确定了螯合物的组成和结构。描述了二茂铁基苯酰腙配体与d区金属的两种不同的配位方式。     

蛋白A连续床亲和毛细管色谱柱的制备及性能考察

人免疫球蛋白 G(HIg G)是一种重要的生物大分子 ,是人血浆中的主要成分之一 ,通常采用免疫学的方法测定 .蛋白 A(Protein A)与免疫球蛋白 (HIg G)的 Fc区之间具有很强的特异性亲和作用 ,因而固载蛋白 A的亲和介质可用于免疫球蛋白及单克隆抗体的分离、纯化和分析测定[1～ 3 ] .根据固定相存在形式的不同 ,毛细管色谱柱主要有开管、填充和连续床柱 3种方式 .连续床具有相比高、易制备 (一步合成 )、孔径易控制、不需烧塞子和易改性等优点 .连续床与其它常用的亲和介质 (如球型凝胶颗粒、灌流色谱基质 [4、 5] 、膜介质 [6,7] 等 )相比具…     

粘度和光谱方法研究二元阴离子型丙烯酰胺共聚物(P3A)在不同pH水溶液中的构象变化

采用粘度和光谱方法,研究了强酸性和弱酸性2种阴离子型单体与丙烯酰胺的三元共聚物(P3A)在稀水溶液中pH诱发的构象变化,P3A聚合物由丙烯酰胺(AM)和强酸性离子单体(AMPS)及弱酸性离子单体(AA)组成.试验结果表明P3A聚合物溶液的粘度随pH呈现非单调的增长关系,在pH为4～5范围内产生急剧的升高,这现象归因于聚合物链团从紧密状态向膨胀状态迅速的转变.这两种状态的溶液粘度变化幅度和聚合物P3A中AMPS和AA组合比例紧密相关,芘探针在聚合物P3A溶液中的荧光强度和pH的关系呈现类似粘度变化的结果.在低pH值时,发现单一弱酸离子共聚物(P2AA)溶液发生相分离,然而在含有强酸单元(AMPS)的P3A聚合物情况下,这种现象不再产生.     

金属硫蛋白家族内的结构域拼接

金属硫蛋白(Metallothioneins,MTs)由结构独立且功能明显区别的β,α两个结构域组成。神经生长抑制因子(NeuronalGrowthInhibitoryFactor,GIF)双名金属硫蛋白-Ⅲ(MT-Ⅲ),是神经系统中第一个被鉴定的具有神经元生长抑制功能的蛋白,而β－结构域为其功能结构域。为深入系统地研究MTs,尤其是GIF及其结构域的结构与功能,我们构建了金属硫蛋白家族内结构域拼接体βGIF-αMT-1(βⅢ-αⅠ)和βMT-1-αGIF(βⅠ-αⅢ):PCR扩增得各个结构域的cDNA序列,酶切后克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,经发酵、诱导表达、亲和层析、凝血酶切和进一步纯化,得率约为80mg蛋白/L菌液。测其电泳行为、氨基酸组成、质谱、金属巯基含量等,证明得到了目的蛋白。紫外吸收图谱和圆二色性图谱显示,结构域拼接体拥有金属硫蛋白家族成员的特征金属巯基簇结构域,初步功能实验表明,βⅢ－αⅠ也具有抑制神经元生长的功能。     

金属硫蛋白加质子常数及与C_d(Ⅱ)络合常数测定

用pH计和Cd离子选择电极测定了金属硫蛋白的加质子常数及其与Cd(Ⅱ)的络合常数,用改进的简化络合模型处理实验结果,得到了去金属硫蛋白(apo MT)中6类不同的加质子基团的数目及其加质子常数。对Cd(Ⅱ)滴定数据的计算表明,MT中两个结构域——α和β对Cd(Ⅱ)的络合常数相差约1000倍。从热力学定量描述了MT中两个结构域结合金属离子选择优先顺序。     

B—DNA分子中互补碱基对G—C、A—T水合作用的研究

本文通过对B—DNA分子中互补碱基对A—T、G—C水合作用的量子化学计算以及最优化处理求得了它们水合作用的最优配位模式。结果表明,当水分子与互补碱基对A—T、G—C共面且水分子与A—T碱基对中胸腺嘧啶(T)杂环上的O_2原子形成氢键以及与G—C碱基对中胞嘧啶(C)杂环上的O_2原子形成氢键时,它们的水合作用具有最稳定的配位模式。     

一种含两对密集二硫键的模拟肽

利用α-芋螺毒素的骨架(CC—C—C)及天然堂皇芋螺毒素的氨基酸组成,设计了一个由11个氨基酸组成的线性短肽NTLCCEGCMCY-COOH.该肽在缓冲溶液中氧化折叠后二硫键只形成一种连接方式[C(1)—C(4),C(2)—C(3)],区别于大部分的α-芋螺毒素的二硫键连接方式[C(1)—C(3),C(2)—C(4)],且该肽具有镇痛活性.这是目前合成的二硫键最密集的α-芋螺毒素样模拟肽,可作为药物分子设计的模板.     

DEPTO R蛋白的表达纯化条件及与mTOR-TRD2亚结构域的相互作用

测试并优化了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)的FAT结构域及其亚结构域TRD2和DEPTOR蛋白在大肠杆菌中的表达条件,获得了TRD2和DEPTOR蛋白成功表达并大量纯化的条件.结果表明,麦芽糖结合蛋白(MBP)融合m TOR的TRD2亚结构域可以在菌株BL21(DE3)中大量表达.DEPTOR-G270P突变比野生型DEPTOR在BL21(DE3)中的表达量提高约5倍,且该突变并不影响DEPTOR自身的二级结构.通过凝胶过滤实验发现,m TOR的TRD2亚结构域和DEPTOR之间可能存在相互作用.     

二[氧合-二(3-二茂铁基丙烯酸二正丁基锡(Ⅳ))]配合物的合成及谱学表征

由FcCH=CHCO2H和(n Bu)2SnO反应合成了{[(FcCH=CHCO2)Sn(n Bu)2]2O}2(A)新配合物[其中Fc=(η5 C5H5)Fe(η5 C5H4)].经红外光谱和核磁共振(1H、13C、119Sn)谱学研究, 确定其组成和结构.提出 [(RCOOSnR′2)2O]2类化合物中一一指认与内环锡、外环锡键连的两类烷基R′中各个碳峰的原则.     

猴金属硫蛋白MT1 α-结构域中Cys33和Cys34的突变对蛋白质稳定性的影响

重组猴金属硫蛋白MT1及其C33M,C34S和C33M/C34S突变体蛋白的蛋白质快速液相色谱(FPLC)分析表明,突变体蛋白C34S和C33M/C34S存在着两个稳定的流分f1和f2.CD光谱和重金属离子分析表明,突变体蛋白多流分不仅与半胱氨酸和Cd2+离子结合方式和构型有关,还与金属结合量有关.突变体蛋白多流分的结果表明,在把猴金属硫蛋白α-结构域中的Cys33和Cys34突变为非半胱氨酸残基以建立β-β结构域的金属硫蛋白时,可导致蛋白形成多种结构形式.这表明α-结构域在稳定金属硫蛋白的结构中起着重要的作用,半胱氨酸残基在肽链上的分布对金属硫蛋白的三级结构和金属硫簇的形成有重大的影响.     

金属硫蛋白加质子常数及与Cd(II)络合常数测定

用pH计和Cd离子选择电极测定了金属硫蛋白的加质子常数及其与Cd(Ⅱ)的络合常数, 用改进的简化络合模型处理实验结果, 得到了去金属硫蛋白(apo MT)中6类不同的加质子基团的数目及其加质子常数。对Cd(Ⅱ)滴定数据的计算表明, MT中两个结构域——α和β对Cd(Ⅱ)的络合常数相差约1000倍。从热力学定量描述了MT中两个结构域结合金属离子选择优先顺序。     

基于2(5H)-呋喃酮的C—C成键反应研究进展

2(5H)-呋喃酮具有多个反应位点,同时其骨架广泛存在于许多天然产物的结构中,因此2(5H)-呋喃酮的衍生化反应具有重要的研究意义.一些简单的2(5H)-呋喃酮分子,如3-位(或4-位)卤代的2(5H)-呋喃酮、5-位无取代基的2(5H)-呋喃酮以及4-羟基-2(5H)-呋喃酮及其衍生物等,可以与有机金属化合物、卤代烃、有机硼化合物、不饱和烃以及不饱和C=X(X=O、N)等多种试剂作用,分别在2(5H)-呋喃酮骨架的3-位、4-位、5-位等不同位置上构建C—C键.鉴于此,以反应试剂为分类依据,综述了近年来基于2(5H)-呋喃酮骨架的C—C成键反应,总结了它们在有机合成方法学中及其生物活性化合物合成应用中的新进展,并指出进一步实现2(5H)-呋喃酮C—C成键反应的绿色化及其高效多环化利用是未来的重要研究方向.     

内质网体中FKBP23与BiP特异性结合

FKBP23是1998年在小鼠的内质网体(endoplasmic reticulum, ER)中发现的一个FKBP家族的蛋白质. 它由一个N端的肽脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase, PPIase)结构域和一个C端的含有钙离子结合功能的结构域组成. 文中在大肠杆菌中克隆表达并纯化了小鼠FKBP23与谷胱甘肽转硫酶(glutathione S-transferase, GST)的融合蛋白GST-FKBP23及内质网体中热激蛋白70(heat shock protein 70, Hsp 70)的成员BiP(immunoglobulin binding protein)的融合蛋白GST-BiP, 并用Factor Xa因子酶切制备游离的FKBP23及BiP. 将结合在还原型谷胱甘肽-Sepharose 4B凝胶上的两种融合蛋白分别交叉地亲和吸附克隆制备的两种游离蛋白, 经免疫印迹证实FKBP23与BiP特异性结合. 进而再用克隆的FKBP23与内质网体蛋白提取液进行上述实验, 进一步证实了FKBP23可与内质网体中天然的BiP结合. 这是首次发现哺乳动物内质网体中肽脯氨酰顺反异构酶的家族成员与分子伴侣(molecular chaperone)的主要成员热激蛋白70具有相互结合的作用.     

基于对叔丁基杯[8]芳烃的3d-5f核簇化合物(M_xTh_y,M=Co、Ni、Zn)的合成、结构与磁性研究(英文)

本文以对叔丁基杯[8]芳烃(H8C8A)为配体,在溶剂热条件下制得了3个3d-5f化合物,[Co2Th4(HC8A)2O2(OH)2(DMF)6](1)、[Ni2Th5(H2C8A)(C8A)O4(OH)2(DMF)5(CH3OH)2](2)、[Zn2Th6(HC8A)(C8A)O5(CH3O)(C3H6NO2)2(DMF)5(CH3OH)](3)(其中H8C8A=对叔丁基杯[8]芳烃,DMF=N,N-二甲基甲酰胺)。X-射线单晶测试表明,这3个化合物均为2个以尾对尾方式排列的杯[8]芳烃分子中间夹1个3d-5f核簇的三明治型结构。杯[8]芳烃均表现为双锥式构型,且每个锥式空腔下缘结合1个钍离子,双锥的连接处及2个杯芳烃分子之间由过渡金属离子或钍离子连接。不同过渡金属离子不同的配位环境导致3种不同核簇的形成。化合物1的磁性研究表明,该化合物在低温下表现出弱铁磁性相互作用。     

4-巯乙基吡啶配基与IgG相互作用的分子模拟研究

4-巯乙基吡啶(MEP)是一种新型的疏水性电荷诱导层析(HCIC)配基,具有良好的抗体分离性能,采用分子模拟方法研究MEP配基与IgG间的分子相互作用,以探讨HCIC分离机制.先通过分子对接搜索IgG分子Fc片段A链的蛋白表面,确定12个可能与MEP结合的位点区域,然后用分子动力学模拟考察了其中6个位点的结合性能.结果表明,MEP在Fc-A链表面的结合具有疏水倾向性,pH中性条件下,MEP能稳定地结合在TYR319和LEU309附近的位点,并与两者形成氢键作用,该区域具有疏水性极强的口袋结构;其他位点的结合较不稳定,受MEP取向影响大.在pH4.0酸性条件下,原先稳定结合的MEP快速从Fc-A链表面脱离,主要原因是MEP和Fc间的静电排斥作用,以及疏水作用减弱和氢键结合的消失.通过分子模拟方法,从分子水平验证了HCIC独特的作用机理:疏水相互作用主导吸附,静电排斥作用协助解吸.