广西巴马小型猪生长素(Ghrelin)cDNA的克隆及序列分析

目的扩增广西巴马小型猪生长素(Ghrelin)cDNA序列,分析其序列结构特点,为进一步从分子水平上对广西巴马小型猪的生长发育提供理论依据,也为日后构建原核表达载体、研究Ghrelin基因的生物功能奠定基础。方法以广西巴马小型猪胃底组织总RNA为模板,用特异性引物扩增Ghrelin的cDNA,纯化连接pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆体,鉴定后测序。结果经测序证实克隆得到的广西巴马小型猪Ghrelin cDNA序列全长为357 bp,与相关文献报道一致。同源性比较发现,广西巴马小型猪Ghrelin cDNA基因序列与GenBank报道的猪相应序列同源性为99.7%,只有一处发生碱基突变。结论本实验成功克隆了广西巴马小型猪Ghrelin cDNA。     

广西巴马小型猪生长激素(pGH)基因全序列克隆及序列分析

目的克隆广西巴马小型猪生长激素(pGH)基因全序列,并与已发表的其它品种猪的生长激素(pGH)基因全序列进行比较,探讨该基因在广西巴马小型猪中可能存在的变异。方法以广西大学巴马小型猪基因组DNA为模板,扩增巴马小型猪生长激素基因的全序列,将该扩增片段亚克隆到pMD18-T载体后测序。再将测序结果在NCBI进行BLAST。结果测序结果证明克隆得到了巴马小型猪GH基因,全长为2 007 bp。同源性比较发现,巴马小型猪GH基因全序列与GenBank中发表的五指山猪、太湖猪及普通猪的GH基因全序列的同源性分别为99.4%、98.3%、93.9%。     

广西巴马小型猪肌肉生长抑制素(Myostatin)cDNA克隆和序列分析

目的通过RT-PCR扩增广西巴马小型猪Myostatin cDNA序列,经过连接、转化、克隆测序后,与NCBI中发表的猪Myostatin序列进行同源性比较,分析广西巴马小型猪Myostatin的cDNA序列结构特点及与其他物种间的聚类关系,为日后构建Myostatin高效表达载体及进一步研究Myostatin对广西巴马小型猪肌肉生长的影响奠定基础。方法以广西巴马小型猪的肌肉组织总RNA为模板,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),利用合成的特异性引物,扩增得到巴马小型猪肌肉生长抑制素(Myostatin)cDNA的全序列。该扩增片段经纯化后,连接到pMD18-T载体上扩增,经一系列鉴定后,测序。结果本实验克隆到巴马小型猪Myostatin基因cDNA序列长度为1128 bp,与GenBank报道的猪Myostatin基因cDNA序列同源性高达99.7%,与人、奶牛、家鼠等物种的cDNA序列间同源性可达到92.3%以上,证明Myostatin基因具有较高的保守性。同时发现广西巴马小型Myostatin基因cDNA序列有三处存在碱基突变,两个为同义突变,一个为错义突变。     

广西巴马小型猪的培育

目的以广西巴马香猪作为原始基础群,要培育出体型尽量小、两头乌毛色整齐、繁殖性能好、遗传性稳定、有关生物学特性明确、适于实验应用的小型猪品系。方法①纯繁闭锁繁育;②封闭群(A系)主要采用群内随机交配方式;③近交系(B系)是在第10世代封闭群的基础上开始选择近交家系,采用连续全同胞兄妹高度近交方式;④定向选择;⑤遗传监测;⑥饲养试验;⑦广西地方标准的制定;⑧有关生物学特性的研究;⑨实验应用。结果①1994年鉴定专家将培育的实验小型猪命名为"广西巴马小型猪",至今己有22年培育历史。②至2009年完成了广西巴马小型猪封闭群21世代的培育。③至2009年完成了广西巴马小型猪近交系11世代的培育。④对小体型、两头乌毛色的整齐性、多产性的选择及性格温顺的驯养均有效。⑤19个微卫星座位上平均观察等位基因数:17世代广西巴马小型猪封闭群为3.00个,在21个微卫星座位上近交系7世代平均观测等位基因数为1.9048个、平均有效等位基因数为1.5461个,平均基因纯合率为0.7232。⑥确认在广西巴马小型猪生长期间营养需要:蛋白质水平12%、能量3100kcal/kg、钙0.65%、有效磷0.32%。⑦在对质量控制因素研究的基础上制定出广西地方标准DB45/T546-2008《实验动物小型猪》(发布日期:2008.09.08、实施日期:2008.10.08)。⑧国内多家研究机构的应用表明广西巴马小型猪是应用于心血管病和糖尿病等研究的优秀模型动物。结论成功培育出适于医学、生物学实验应用的、具有独特优异特性的广西巴马小型猪封闭群和近交系。     

广西巴马小型猪促生长激素释放激素成熟肽的克隆及序列分析

目的扩增广西巴马小型猪促生长激素释放激素(GHRH),分析其序列结构特点。方法以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,用特异性引物扩增GHRH外显子3,再用引物延伸悬挂PCR法扩增GHRH成熟肽,纯化后,连接、转化到大肠杆菌,筛选阳性克隆,测序。结果经测序证实广西巴马小型猪GHRH外显子3及其成熟肽的基因序列与相关文献报道一致。克隆得到的广西巴马小型猪GHRH序列全长为132 bp,其中外显子3基因序列长105bp。同源性比较发现,广西巴马小型猪GHRH外显子3基因序列与GenBank(NCBI)中报到的猪GHRH外显子3相比,同源性为97.14%,有3处发生碱基变化。结论本实验成功克隆了广西巴马小型猪GHRH成熟肽序列。     

广西巴马小型猪 ApoE 基因外显子 2 片段的多态性分析

摘要: 目的 克隆广西巴马小型猪载脂蛋白 E( ApoE) 基因外显子 2 片段并分析该片段的多态性,为建立广西巴马 小型猪动脉粥样硬化模型奠定基础。方法 以广西巴马小型猪基因组 DNA 为模板,PCＲ 扩增 ApoE 基因片段,应 用 PCＲ-SSCP 方法分析其多态性。结果 克隆获得长 237 bp 的 ApoE 基因外显子 2 片段,测序结果比对参考序列同 源性为 100% 。PCＲ-SSCP 分析发现在该片段的 229 位点存在多态性,表现为 AA 型、AT 型和 TT 型 3 种基因型。结 论 成功克隆广西巴马小型猪 ApoE 基因外显子 2 片段,该片段存在多态性,有 AA、AT 和 TT 3 种基因型,基因型频 率分别为 0. 302、0. 489 和 0. 209。     

广西巴马小型猪不同年龄生殖激素水平的分析

目的探讨广西巴马小型猪不同年龄生殖激素水平。方法利用ELISA酶免疫试剂盒和多功能标记免疫测定系统,对不同年龄的雌雄巴马小型猪血清生殖激素浓度进行测定。结果雄性巴马小型猪血清TESTO、FSH浓度从2月龄到6月龄呈上升趋势,在6月龄时达到最大值(分别为12.2 ng±8.9 ng/mL和64.6 ng±6.1 ng/mL),6月龄后浓度呈下降趋势;血清LH浓度从2月龄到4月龄呈上升趋势,在4月龄时达到最大值(46.8 ng±12.5 ng/mL),4月龄后呈下降趋势。雌性巴马小型猪从2月龄到4月龄,血清FSH、LH、E2浓度都呈现出显著升高趋势,到4月龄时达到最大值(分别为51.9 ng±54.0 ng/mL,23.2 ng±31.6 ng/mL,79.3 pg±93.0 pg/mL),4月龄后又都呈现较明显下降趋势。     

广西巴马小型猪雄性初情期和精液性状的分析

目的探讨广西巴马小型猪雄性初情期和精液品质性状。方法将15、20、25、26、27、28、29、30、45、55、62、75日龄巴马小型猪睾丸制作成切片,检查其曲细精管中是否已经产生精子;采集巴马小型猪精液,检测其物理性状和化学成分。结果初步判断雄性巴马小型猪的初情期为45日龄左右。巴马小型猪精液的主要物理性状:射精量107.5 mL±39.0 mL、酸碱度7.6±0.3、精子密度0.732亿/mL、精子活率0.754±0.079、精子活力0.376±0.168、精子畸形率0.256±0.159。主要化学成分:Na+1.56 mg±0.13 mg/mL、K+0.78 mg±0.06 mg/mL、Cl-1.62 mg±0.18 mg/mL、磷脂8.7 mg±0.2 mg/100 mL、果糖117.4 mg±81.0 mg/100 mL、柠檬酸45.6 mg±77.6 mg/100 mL。     

广西巴马小型猪卵泡抑素(Follistatin)克隆及原核表达

目的通过RT-PCR扩增获得广西巴马小型猪Follistatin的cDNA全序列,经克隆测序分析其cDNA序列结构,进而构建pET-Fo原核表达质粒,使用IPTG诱导表达获得其融合蛋白,为将来进一步研究Follistatin对广西巴马小型猪肌肉生长和繁殖性能的影响奠定基础。方法从广西大学巴马小型猪卵巢中提取总RNA,并以其为模板,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),在合成的特异性引物引导下,扩增获得广西巴马小型猪卵泡抑素(Follistatin)cDNA的全序列,长度为1 035 bp。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析。结果广西巴马小型猪卵泡抑素cDNA序列与GenBank中已报道的家猪卵泡抑素同源性高达99.4%。同时,将目的基因插入到原核表达载体pET 32a 多克隆位点中,构建了Follistatin的原核表达载体,并转化于大肠杆菌BL21。转化菌经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。结论实验已成功地表达了Follistatin的融合蛋白(约58.4 ku)。     

广西巴马小型猪生长期日粮蛋白与能量水平需要的测定

目的本试验对生长期(45~117日龄)的广西巴马小型猪进行了生长饲养实验。方法试验一:选择40头40日龄断奶广西巴马小型猪,按平均体重随机分为四组(10头/组)。在45~80日龄,四个组分别喂以含蛋白质水平为13%、14%、16%、18%的日粮;在81~117日龄,仍以上面的40头广西巴马小型猪为实验材料,分别喂以含蛋白质水平为11%、12%、13%、14%的日粮。试验二:选择40头40日龄断奶广西巴马小型猪,按平均体重随机分为四组(10头/组)。分别喂以日粮1(CP15%、DE12.95 MJ/kg),日粮2(CP15%、DE13.37 MJ/kg),日粮3(CP13%、DE12.95MJ/kg)和日粮4(CP13%、DE13.37MJ/kg)。结果在45~80日龄,上述不同蛋白质含量的日粮对广西巴马小型猪的总增重影响差异不显著(P>0.05);在81~117日龄,蛋白水平为12%、13%、14%的日粮对小型猪的总增重影响差异不显著(P>0.05),但蛋白质水平为11%的日粮组总增重显著低于前面三组(P<0.05)。试验二的结果表明,4种不同能量与蛋白组合的日粮对生长期(45~75日龄)小型猪的总增重影响差异不显著(P>0.05)。结论本实验结果表明广西巴马小型猪生长期(45~117日龄)日粮营养需要水平为粗蛋白12%~13%,消化能12.95 MJ/kg。日喂料量为体重的2.0%~2.25%即可维持广西巴马小型猪的生长期(45~117日龄)较缓慢的生长速度。     

中国小型猪FasL的cDNA克隆及序列分析

以广西巴马小型猪活化的外周血淋巴细胞为材料，抽提总RNA，反转录成cDNA，参照人FasL基因保守序列设计引物，扩增得到包括全长阅读框序列的特异性DNA片段，将其克隆于T-vector，以双脱氧法完成测序，在国际上首次完成中国小型猪FasL基因序列（GenBank登录号：AY033634），该序列全长846bp，编码282个氨基酸的CD95L分子，为Ⅱ型膜蛋白，其膜内部分含脯氨酸残基，通过比较分析发现，小型猪与人FasL基在的核苷酸序列同源性为87%，氨基酸序列同源性为88%，比人的FasL基因多一个氨基酸，这些数据将为进一步用小型猪作为实验动物进行生物学和免疫应答研究提供必要的资料。     

固力本钙离子在广西巴马小型猪中注射效果初探

目的以广西巴马小型猪作为实验动物,探讨固力本钙离子用于静脉注射、肌肉注射和皮下注射的可行性。方法去甲肾上腺素静脉滴注巴马小型猪12次(用量2.0 mg/kg体重);固力本钙离子静脉滴注巴马小型猪和用过去甲肾上腺素的实验猪(1粒钙离子的稀释液分别为100 mL~200 mL的生理盐水、葡萄糖水和蒸馏水);固力本钙离子肌肉注射、皮下注射巴马小型猪(1粒钙离子的稀释液分别为100 mL~200 mL的生理盐水、葡萄糖水和蒸馏水);对照巴马小型猪静脉滴注生理盐水50 mL。结果钙离子静注过程中实验猪大多会表现心率、呼吸减缓,实验猪无异常反应,表现安静;钙离子静注稀释液用蒸馏水较好;以2.3 mg/mL的浓度滴注较合适。静注去甲肾上腺素过程中实验猪心率、呼吸加快,反应激烈;经去甲肾上腺素静注后的巴马小型猪对钙离子静脉注射的反应则完全不同,表现安静。钙离子肌肉注射和皮下注射实验猪均无不良反应。结论通过对巴马小型猪的实验,初步确认固力本钙离子可用于静脉注射、肌肉注射和皮下注射。     

巴马小型猪1 型糖尿病模型的建立

摘要: 目的建立链脲佐菌素( streptozotocin,STZ) 诱导巴马小型猪糖尿病模型。方法10 头小型猪随机分3 组,设为对照组( 2 头) 、实验1 组( 2 头) 和实验2 组( 6 头) ,分别静脉注射生理盐水、120 mg /kg 的STZ 和150 mg /kg 的STZ。在应用STZ 后24h 内,每小时检测一次血糖,此后每天一次,1个月后处死动物,取胰腺做病理学检查。结果120 mg /kg 的STZ 可引起一过性糖尿病,血糖在17 d 后逐渐恢复。150 mg /kg 的STZ,引发3 /6 头小型猪严重的糖尿病,血糖维持在16. 1 ～ 35. 0 mmol /L 之间,不能自发恢复; 2 /3 头小型猪呈一过性高血糖,类似应用120 mg /kg 的STZ 组动物的变化; 此外,还有1 /6 头动物未发生明显的高血糖。结论巴马小型猪一次性静注120 mg /kg 的STZ可引起一过性糖尿病, 150 mg /kg 的STZ 可引起严重的糖尿病,动物对STZ 的反应个体差异很大。     

特制眠乃宁及氯胺酮对广西巴马小型猪的麻醉观察

目的观察特制眠乃宁及氯胺酮对广西巴马小型猪的麻醉效果。方法选用15头雌性健康广西巴马小型猪,分别用特制眠乃宁及盐酸氯胺酮注射液进行麻醉,试验前后的条件一致,评价方法相同。结果用盐酸氯胺酮麻醉的动物,只有2例勉强完成操作;用特制眠乃宁麻醉的动物,多数可以很快进入麻醉状态,其余动物追加药物的1/3可以达到麻醉效果。结论与氯胺酮相比,眠乃宁使用量小、麻醉效果好。     

五指山小型猪PMSA6基因cDNA克隆及生物信息学分析

为了对海南五指山小型猪蛋白酶体亚基α型6（proteasome subunit alpha type 6,PMSA6）cDNA基因进行克隆和生物信息学分析,笔者以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到PMSA6全长cDNA,并向GenBank递交了该序列（登录号：FJ358606）．同时运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列进行了分析,并预测了其编码蛋白的理化性质及二级结构等．生物信息学分析表明：该cDNA全长1029bp,5’非翻译区长96bp,3’非翻译区长192bp,含有一个741bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸．该蛋白的分子量为37．680kD,等电点为8．76．进一步比对分析发现,五指山小型猪PMSA6基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、牛等哺乳动物具有很高的相似性．本研究成功克隆了海南五指山小型猪P肛SA6基因cDNA,并进行了相关生物信息学分析,为进一步研究PMSA6在动物体内的作用机理奠定了基础．     

全身麻醉对巴马小型猪空腹血糖测定的影响

目的 探讨全身麻醉对高糖高脂饲料诱导的2型糖尿病巴马小型猪空腹血糖的影响。方法 巴马小型猪16头随机分为2组每组8头,对照组为正常饲料组,实验组为高糖高脂饲料诱导组。对16头巴马小型猪分别在全身麻醉前后测定空腹血糖,麻醉前后的血糖值进行组内、组间统计分析。结果 两组小型猪在麻醉前后空腹血糖值差异显著,高糖高脂饲料组麻醉后空腹血糖值升高与对照组差异极显著。结论 全身麻醉后巴马小型猪空腹血糖值明显升高,高糖高脂诱导的巴马小型猪2型糖尿病动物模型空腹血糖升高更为显著。     

高脂高糖饮食对巴马小型猪肠道菌群的影响

目的 探讨高脂高糖饮食8个月对巴马小型猪血脂和粪便中肠道菌群的影响。方法 将10头巴马小型猪随机分为对照组(n=3)和实验组(n=7),对照组小型猪正常喂养,实验组给予高脂高糖饮食。各组动物分别于实验前及实验8个月后进行空腹采血,检测三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇等血脂指标。实验8个月后无菌采集各动物粪便,采用16S rRNA测序技术检测肠道菌群组成。结果 高脂高糖饮食8个月后,实验组粪便中肠道菌群物种数量未见明显改变,厚壁菌门相对丰度增加,拟杆菌门和变形菌门丰度降低(P<0.05)。实验组小型猪体质量、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论 高脂高糖饮食可以增加巴马小型猪粪便中厚壁菌门相对丰度,降低拟杆菌门和变形菌门相对丰度,提示这些肠道菌群的失调可能参与调节了宿主高脂血症的发生。     

小型猪生长激素基因研究进展

小型猪(Miniature pig)由于其体型小、饲料消耗少、便于操作、世代间隔短、具有大家畜和实验动物的双重特点,因此是一种理想的实验动物模型。目前主要应用于医学中的新药开发与鉴定、胚胎工程技术、心血管模型建立等研究领域[1]。猪生长激素(Porcine growth hormone,PGH)是由猪     

实创巴马小型猪疑似糖尿病敏感个体筛选实验

目的筛选疑似糖尿病敏感小型猪。方法测定79头(10-14月龄)实创巴马小型猪的体重指数、糖耐量, 以及空腹血清GLU、TG、TC、HDL-c和LDL．C值,以空腹血糖值和糖耐量试验120 rain血糖值为主要依据,同时参考 其他相关检测指标,选择疑似糖尿病敏感小型猪。结果选择2对小型猪开始繁殖实验。     

2型糖尿病易感小型猪遗传选育研究进展(一)

由于小型猪代谢机制与人类十分相似,使其成为糖尿病研究的理想动物模型。然而在作为家畜的长期选育过程中,小型猪获得了抵抗致糖尿病因素的特性。本实验室经过对245头成年巴马小型猪的空腹血糖筛选,获得了一头孕期高血糖的个体,这头猪生产了11头后代(存活10头),我们以这10头小型猪为基础,以高糖高脂饲料诱导过程的表现性状作为选育条件,经过2世代的选育,小型猪的糖尿病易感性从诱导7个月发病,进展为6个月发病。因此,推测有希望获得一个糖尿病易感的小型猪新品系。