蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的逆反应中的磷酰化作用

本文证明在蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的反应体系中,若有非水磷酸受体存在,其底物果糖1,6-二磷酸的1位磷酰基能转移到这些受体上形成有机磷化合物,导致F6P的释放速度快于无机磷的释放。用~(32)P-无机正磷酸和蛇肌酶一起保温,可分离出被无机磷共价磷酰化的酶中间物。这个磷酰化中间物可能和酶的正反应催化过程有关。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的限制性酶解

蛇肌果糖1.6-二磷酸酯酶被枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶限制性酶解,可分别产生29000和7000或32000和4000的肽段。酶解产物在pH7.5和pH9.2分别有2倍和4—5倍的激活,pH7.5的激活作用,仅可用无机磷测活法观察到。5′AMP对该产物的别构抑制作用部分或全部丧失。本文与文献[1]的结果使我们提出了天然状态的蛇肌酶的催化部位的结构是不完善的看法。被限制性酶解的蛇肌酶受6-磷酸果糖激活,同时又受6-磷酸葡萄糖酸,6-磷酸葡萄糖和还原型辅酶Ⅱ的抑制。因此限制性酶解作用可能在蛇肌中有一定生理功能。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶与腺苷—磷酸的相互作用和抑制的机制——紫外差光谱的研究

本文证明别构抑制剂AMP和dAMP与蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶结合的差光谱,都有270,280和288nm正峰,此外dAMP尚有275nm正峰。计算得到两者结合常数分别为2.0×10~6M~(-1)和1.2×10~6M~(-1)。两者抑制行为不同和AMP的核糖上的2′-羟基与酶的别构部位相互作用有关。胰蛋白酶的限制性酶解引起该酶活力增加,同时受AMP抑制作用丧失,在差光谱上表现为280和288nm负峰,其特征和酶的脲素差光谱一致。说明高活性酶是处于结构松散状态,受AMP抑制的酶则处于紧凑状态,此二种状态均伴随着酪氨酸残基的微环境的改变。     

应用Atherton-Todd反应进行酪氨酸O-磷酰化

蛋白质磷酸化是细胞内调节酶功能的一种重要的翻译后修饰 .蛋白质内酪氨酸磷酰化是目前所知道的在细胞应答外界刺激时最主要的信号传导方式 [1] .文献 [2 ]报道的酪氨酸 O-磷酰化的方法是基于亚磷酰胺化学 ,包含亚磷酸化和氧化两步 .我们在 O-磷酰化多肽的合成研究中发现 ,应用 Atherton-Todd反应可以有效地进行酪氨酸 O-磷酰化 .Atherton- Todd反应是指二烷基亚磷酸酯在四氯化碳和有机碱 (如三乙胺 )存在下转变成二烷基磷酰氯 ,从而进行胺、亚胺及肟的磷酰化 .该法曾被有效地用于在弱碱性水溶液中合成 N - (二烷基磷酰 )氨基酸和小肽 […     

果糖-1,6-二磷酸盐和硫酸镁在水及血浆中的电导

果糖-1,6-二磷酸镁(monomagnesium fructose-1,6-diphosphate,FDPMg)分子有药效,其保护心肌缺血性损伤的效果优于果糖-1,6-二磷酸钠(trisodium fructose-1,6-diphosphate,FDPNa)和硫酸镁。本文考察FDPMg等在水溶液和血浆中的解离情况。     

核苷环磷酰化反应中的立体化学

我们曾经报道了腺嘌呤核苷3′,5′-环磷酸酯和3′,5′-环磷酰胺对肿瘤细胞的DNA和RNA的合成有明显的抑制作用^[1]。研究这类化合物对进一步了解c-AMP在生物系统中的作用机制以及它们与蛋白激酶和磷酸二酯酶的作用情况有一定价值^[2]。因此在合成一系列腺嘌呤核苷3′,5′-环磷酸酯和3′,5′-环磷酰胺的基础上^[1～3],我们用2′-保护核苷与三价磷试剂反应,经过一步环磷酰化反应合成了核苷3′,5′-环亚磷酸衍生物,后者经氧化和脱保护即可得到核苷3′,5′-环磷酸衍生物。本文将报道核苷环磷酰化反应中的立体化学问题。     

N-磷酰化肽酯及小肽与溶菌酶相互作用的ESI-MS研究

用ESI-MS研究了一系列结构具有可比性的N-磷酰化肽酯及小肽和溶菌酶的非共价相互作用, 比较了磷酰化肽酯及小肽分子中的不同基团对相互作用的影响. 结果表明—OH对其与溶菌酶的相互作用有较大贡献; 芳香环由于位阻原因, 对相互作用有促进和阻碍双重效应; 当—OH与芳香环相连时会发生协同效应, 可使相互作用显著增强. 磷酰化肽酯及小肽的体积大小、空间位阻对相互作用亦有显著影响. 磷酰化二肽中氨基酸残基的构型、顺序、碳链长短的变化(增加1～2个C)对其与蛋白溶菌酶之间的相互作用在质谱中没有表现出影响. 分子结构较为伸展、分子柔顺性好、空间位阻较小的磷酰化小肽更容易使蛋白在溶液中的构象趋于收缩, 而构象较为收缩的蛋白分子更易结合空间位阻较小的磷酰化小肽分子.     

甜菊叶肉细胞FDPase和UDPG焦磷酸化酶的电子显微镜细胞化学研究

本文研究了糖代谢中两种重要的酶——果糖1,6-二磷酸酶(FDPase,EC3.1.3.11)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)焦磷酸化酶(尿苷三磷酸:α-D-葡萄糖1-磷酸尿基转移酶,EC2.7.7.9)在新糖源植物——甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)叶肉细胞中的亚细胞定位和不同叶龄叶片中酶活性的变化。本实验揭示:FDPase是一种膜束缚酶,它特异性地定位于叶绿体的类囊体膜和细胞质膜。在幼叶细胞中,FDPase定位于叶绿体类囊体膜;在成叶细胞中,FDPase定位于叶绿体类囊体膜和细胞质膜。UDPG焦磷酸化酶以游离的形式分布于细胞基质中,以膜束缚的形式定位于高尔基扁平囊和高尔基小泡。本研究表明:叶绿体、细胞基质和高尔基复合体在甜菊苷合成中具有重要的作用。     

果糖-6-磷酸-2-激酶的色氨酸残基的研究

NBS滴定PFK-2的紫外光谱的结果表明,该酶可滴定Trp残基数为4个其中2个是活性必需的。 用295nm的紫外光激发果糖-6-磷酸-2-激酶(PFK-2),在335nm附近有较强的发射荧光。该荧光能较专一反映PFK-2的Trp基团的状态。底物果糖-6-磷酸对该荧光不影响,ATP引起荧光吸灭。最大吸灭幅度为30％左右。 采用荧光滴定方法测定ATP与酶的结合,得出解离常数(K_i)在低浓度ATP时为0.033mmol/L,高度时为0.23mmol/L。表明该结合具有负协同性。Mg~(2+)、无机磷均降低ATP与酶的K_i值而表现为激活因子;果糖-6-磷酸和果糖-2,6-二磷酸酸对K_i值不影响。ATP结合后引起了该酶构象上的较大的变化。 在ATP保护下,PFK-2对NBS的失活速度稍有增加。丙烯酰胺荧光滴定的结果是,在有无ATP时的Stern-Volmer常数(K_(SV))皆为4.0。     

基于生物质谱技术的磷酰化修饰策略在多肽测序中的应用

该文建立了一种利用磷酰化修饰结合电喷雾质谱(ESI-Q-TOF)测定多肽氨基酸序列的有效方法。利用Atherton-Todd反应,以二丙基亚磷酰酯(DPP)为磷酰化试剂,应用生物质谱技术,对磷酰化修饰后的5种模型肽的磷酰化反应情况进行了系统研究,考察了磷酰化肽的二级质谱特征,并与未经磷酰化反应的肽的二级质谱特征对比。结果表明,经过磷酰化修饰后,肽的二级质谱中的a1离子信号强度明显增加,可以准确鉴定其N端氨基酸;b系列离子信息完整,信号强度增强,使得多肽C ID测序的谱图简单、清晰,有利于肽的氨基酸序列的测定;赖氨酸(K,128.10 u)和谷氨酰胺(Q,128.13 u)两种氨基酸质荷比相近,由于二者磷酰化修饰后的差异性,使其得到准确区分。经过5种已知氨基酸序列的模型肽的磷酰化后结合质谱技术进行氨基酸序列测定验证,结果表明该方法简单、快速、准确,提高了利用质谱技术进行多肽测序的准确度和灵敏度,可为蛋白质组学研究提供有效的技术手段。     

磷酰化组氨酸特异性抗体的制备与应用

以4-碘吡唑和亚磷酸二乙酯为初始原料,经3步反应合成了新型的磷酰化组氨酸结构类似物,并以其为半抗原制备了磷酰化组氨酸特异性抗体(Anti-pHis).采用酶联免疫吸附(ELISA)、斑点印迹(Dot blot)和免疫印迹(Western blot)实验等方法对Anti-pHis的特异性进行了检测.结果表明,Anti-pHis对组氨酸磷酰化蛋白表现出优异的亲和力和选择性识别能力,并可应用于微生物细胞裂解液中组氨酸磷酰化蛋白的检测.     

二乙氧基磷酰化香豆素的合成与表征

在生命过程中磷酰化和去磷酰化起着重要作用。一些生物分子和药物分子磷酰化后具有特殊的生物活性。我们已经利用Atherton-Todd反应合成了磷酰化氨基酸,并对酚羟基进行了磷酰化,发现它是一个有效的制取磷酸酯衍生物的方法。     

N-磷酰化肽酯及小肽与氨基酸相互作用的ESI-MS研究

采用ESI-MS研究了一系列结构具有可比性的N-二异丙氧基磷酰化肽酯及小肽同20种蛋白氨基酸及3种D型氨基酸(D-Ala、D-Ser、D-Phe)的非共价相互作用.结果表明,可形成π-π共轭体系的芳香环,可显著增强磷酰化肽酯及小肽与氨基酸的相互作用力,π-π堆积力是首要的非共价相互作用力;可形成氢键的极性基团有利于形成复合物,但能否形成氢键还要受到分子柔顺性的影响;另外,分子大小、空间位阻对复合物的形成也有影响;而氨基酸的手性对它们的相互作用在质谱条件下没有表现出影响.     

荧光猝灭法测定磷酰化氨基酸

建立了通过磷酰化氨基酸水解产生无机磷酸盐猝灭铽离子-钛铁试剂络合物(Tb3 -TR)荧光探针的间接荧光法测定三种磷酰化氨基酸。在最佳实验条件下,方法测定磷酰化丝氨酸(P-Ser)、磷酰化苏氨酸(P-Thr)和磷酰化酪氨酸(P-Tyr)的线性范围分别为5.0×10-8~5.0×10-7mol/L、5.0×10-8~6.0×10-7mol/L、5.0×10-8~6.0×10-7mol/L;检出限分别为2.06×10-8mol/L、1.13×10-8mol/L和1.74×10-9mol/L。该方法最后用于卵黄高磷蛋白中含磷量的测定,取得定量结果。     

磷酰化剂的进展

只要提及光合作用、新陈代谢、糖的合成、核酸、磷脂以及磷所参与的辅酶,就可知道磷在生物体中占有极其重要的地位,而这一切都与磷酰化反应密切相关。磷酰化反应是指将磷酰基[(RO)_2P(O)—]从磷酰化剂转移至一个亲核中心以生成新的有机磷酸衍生物,而凡能以游离形式(R=H)或酯化形式(R=烃基)将磷酰基进行转移的化合物均可称作磷酰化剂。     

反相高效液相色谱法测定磷酸果糖激酶的活性

采用反相高效液相法(RP-HPLC)测定磷酸果糖激酶的活性.将磷酸果糖激酶与含有果糖-6-磷酸和ATP的反应体系混合,置于30℃水浴中,反应20 min后,沸水浴3 min终止反应.通过RP-HPLC测定酶反应前后产物二磷酸腺苷(ADP)量的变化来分析酶的活性.ADP的生成量在5～400 mg/L范围内具有良好的线性关系,方法的精密度良好(RSD<5%).本方法与通常所用的酶偶联法(ECM)相比准确度高,且简便易行.     

N-磷酰化氨基酸与核糖核苷反应的研究

研究了Ｎ－磷酰化氨基酸与核苷在水溶液中的反应，反应中能够同时生成小肽和小的寡核苷酸；不同的Ｎ－磷酰化氨基酸与不同的核苷之间的反应具有一定的选择性。     

蓝藻FBP/SBPase的制备及其与配体相互作用的分析——科研转化的化学生物学综合实验设计

以蓝藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶为靶酶,异源表达获得靶酶,分析靶酶的纯度及含量,探讨配体与靶酶的相互作用。通过本实验,学生掌握获取靶酶的方法,掌握靶酶与配体相互作用的分析方法,了解药物筛选模型建立的研究思路及实验技术,提升分析、解决问题及综合运用知识的能力,增强科研服务社会意识及责任感。     

磷酰化丝氨酸形成六配位磷中间体的理论研究

用MNDO方法对磷酰化丝氨酸仿生化反应机理中六配位磷中间体的形成过程进行了研究.磷酰化丝氨酸(1)形成分子内磷酸-羧酸分子内混酐的五配位磷中间体(2)后,其酸性质子解离,分子经过具有氢桥键结构的过渡态,使氨基酸侧链羟基上的氢通过氢键作用向磷上的O₁进行转移,然后再经过构型由三角双锥向八面体的转变,形成六配位磷中间体(3).氢桥键的存在使反应过渡态能量降低,其相对能量为148.5kJ/mol.理论计算较成功的解释了六配位磷中间体的形成机理以及磷酰化丝氨酸仿生化反应中羧基和侧链羟基共同参与的实验结果.     

有机磷化合物的研究 XXI:两可阴离子的区域选择性磷酰化反应

本文报道某些两可阴离子磷酰化反应的区域选择性.苯基丙酮双阴离子与二乙基磷酰氯反应,除O-磷酰化产物的顺,反异构体外,还得两个C-磷酰化产物.烯丙基苯碳阴离子与二乙基磷酰氯反应未获得预期产物,苯乙酮的环已胺Schiff碱作为两可阴离子,在磷酰化反应中可获得以C-磷酰化为主的三种产物.本文对双阴离子的化学结构与磷酰化反应区域选择性的影响作了讨论.