4-羟基苯乙烯基吡啶为HRP底物的酶荧光免疫传感体系测定布氏杆菌抗体

本文合成了一种新型辣根过氧化物酶（HRP）荧光底物—4-羟基苯乙基吡啶（pHSP）,并首次将它运用于酶联荧光免疫传感体系。对pHSP化学性质的研究证实,pHSP在空气中较稳定,对HRP、H2O2的荧光响应性能优于传统HRP荧光底物如对羟苯乙酸、Amplex Red和佳味醇等。pHSP本身只有极弱的荧光,在HRP催化下可被 H2O2氧化成二聚体产物,该二聚体在300 nm的激发光下能发射波长为437 nm的强荧光,并且反应体系的荧光增加与HRP量在一定浓度范围内成线形相关。根据此原理,建立了兔布氏杆菌抗体的酶联荧光传感分析新方法。运用制备的传感装置测定兔布氏杆菌抗体的线形范围为110-5 1.6 10-3 g/L,抗体检出限为110-5 g/L,相对标准偏差为4.1%（n=11）。 pHSP的二聚体产物水溶性很低,利用设计的装置较好地解决了传统测定溶液体系方法灵敏度打折的问题。     

以葛根素为辣根过氧化物酶底物的新体系及其分析应用

以一种天然活性成分葛根素(Puerarin)为辣根过氧化物酶(HRP)底物建立了葛根素-辣根过氧化物酶-过氧化氢反应新体系. 在反应体系中 HRP 催化H₂O₂ 氧化葛根素(弱荧光)形成二聚体产物(强荧光), 该产物在315 nm 的激发光下能发射波长为478 nm的强荧光, 并且反应体系荧光强度增加与HRP量在一定浓度范围内呈线性相关. 根据此关系和竞争型免疫定量原理, 以兔布氏杆菌抗体为分析对象建立了基于葛根素的酶联荧光免疫传感分析新方法. 对葛根素性质的研究结果证实, 葛根素在空气中稳定、对温度稳定, 对H₂O₂＋HRP 敏感性优于传统底物如对羟基苯乙酸、Amplex Red和高香草酸. 优化了酶联荧光免疫传感分析方法的实验条件如HRP-BrAb 用量、温度等. 运用新体系测定了兔血清样品的布氏杆菌抗体, 该方法线性范围为1.3～120 ng/mL, 检测限为1.3 ng/mL (3σ), 相对标准偏差为3.8%.     

白藜芦醇作辣根过氧化物酶底物的布氏杆菌抗体酶联免疫传感器研究

一种纯天然产物白藜芦醇用作辣根过氧化物酶(HRP)底物。对其化学性质的研究证实,白藜芦醇在空气中较稳定,对HRP、H2O2的电化学响应性能优于传统HRP底物,对人体无毒害。白藜芦醇在HRP催化下可被H2O2氧化成醌,产物醌在电极上于-376 mV处可被还原,其电流的大小与HRP的浓试在一定浓度范围内呈线性相关。将兔布氏杆菌抗原包埋在石墨-石蜡基质中制备了测定兔布氏杆菌抗体的电化学酶联免疫传感器,该传感器测定兔布氏杆菌抗体的线性范围为3×10-4~1.65×10-2g/L;检出限为1×10-4g/L;RSD为4.6%。本方法制备免疫传感器的电化学性能稳定,抗原活性保持良好。     

基于新型HRP底物白藜芦醇和Ag/SiO_2纳米粒子的酶联荧光免疫传感体系

以一种纯天然产物——白藜芦醇(resveratrol,RST)作为辣根过氧化物酶(HRP)荧光底物运用于酶联荧光免疫传感体系.RST对HRP,H2O2的荧光响应性能优于传统HRP荧光底物,诸如对羟苯丙酸、AmplexRed和佳味醇.RST本身只有极弱的荧光,在HRP催化下可被H2O2氧化成二聚体产物,该二聚体在315nm的激发光下能发射波长为462nm的强荧光,并且反应体系的荧光强度增加值与HRP量在一定浓度范围内成线性相关.根据此关系和竞争型免疫定量原理,以日本血吸虫抗体(SjAb)为模型分析对象,建立了基于新HRP荧光底物的酶联荧光传感分析新方法.运用制备的传感装置测定SjAb的线性范围为1.5×10-6～7.3×10-4g/L,检出限为1.5×10-6g/L,测定浓度为5×10-6g/LSjAb的相对标准偏差为4.7%(n=10).RST的二聚体产物水溶性很低,通过该装置可将酶反应产物沉积在具Ag/SiO2纳米粒子的传感界面上,利用纳米Ag/SiO2对产物吸附富集作用,不仅解决了传统方法不便于测定低水溶性的产物的问题,而且提高了分析灵敏性.     

基于新型HRP底物白藜芦醇和Ag／SiO2纳米粒子的酶联荧光免疫传感体系

以一种纯天然产物——白藜芦醇（resveratrol,RST）作为辣根过氧化物酶（HRP）荧光底物运用于酶联荧光免疫传感体系．RST对HRP,H2O2的荧光响应性能优于传统HRP荧光底物,诸如对羟苯丙酸、Amplex Red和佳味醇．RST本身只有极弱的荧光,在HRP催化下可被H2O2氧化成二聚体产物,该二聚体在315nm的激发光下能发射波长为462nm的强荧光,并且反应体系的荧光强度增加值与HRP量在一定浓度范围内成线性相关．根据此关系和竞争型免疫定量原理,以日本血吸虫抗体（SjAb）为模型分析对象,建立了基于新HRP荧光底物的酶联荧光传感分析新方法．运用制备的传感装置测定SjAb的线性范围为1．5×10^-6～7．3×10^-4g／L,检出限为1．5×10^-6g／L,测定浓度为5×10^-6g／L SjAb的相对标准偏差为4．7％（n=10）．RST的二聚体产物水溶性很低,通过该装置可将酶反应产物沉积在具Ag／SiO2纳米粒子的传感界面上,利用纳米Ag／SiO2对产物吸附富集作用,不仅解决了传统方法不便于测定低水溶性的产物的问题,而且提高了分析灵敏性．     

矢车菊甙-辣根过氧化物酶-过氧化氢新体系及其在酶联免疫传感分析中的应用

以一种天然色素矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucose,CAG）为辣根过氧化物酶（HRP）底物建立了矢车菊甙-辣根过氧化物酶-过氧化氢新体系.CAG在540nm处有一个吸收峰（AP1）,在HRP催化下被H2O2氧化,AP1降低;同时,其氧化产物在482nm处产生一个新吸收峰（AP2）,并且反应体系中两峰值的比值R（AP2/AP1）与HRP量在一定浓度范围内呈线性相关.根据此原理,以猪口蹄疫病毒蛋白（food and mouth disease virus antigen,FMDVAg）为分析模型,建立了检测猪口蹄疫病毒的酶联免疫传感分析新方法.该方法利用伴刀豆蛋白（Conconvalina,ConA）对糖蛋白的识别特性固定HRP-猪口蹄疫病毒抗体连接物（HRP-FMDVAb）,由ConA介导和磁性分离实现了免疫反应特异性组分和非特异成分,以及反应免疫磁性珠与没反应免疫磁性珠的分离.运用制备的传感体系测定猪口蹄疫病毒的线性范围为1.5×10^-8～2.7×10^-6g/mL,抗原检出限为3.1×10^-9g/mL,相对标准偏差为3.7%（n=11）.底物CAG及其产物的水溶性好,对人体无毒副作用,在临床上可代替传统HRP底物进行免疫检测.     

基于固体酶催化反应电化学测定酶含量

提出了以固体辣根过氧化物酶(HRP)对过氧化氢氧化邻苯二胺的催化作用为基础的测定HRP及其标记物的电化学方法.测定中以Au-Pt/PAN/GCE为工作电极,并详细叙述其制备过程.将一定浓度的HRP按规定方法固定在上述修饰电极上制得HRP/Au-Pt/PAN/GCE修饰电极,将此电极浸入含5.0×10-3mol·L-1邻苯二胺及2.5×10-3mol·L-1过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中,反应10 min后将电极取出,记录溶液中酶催化反应产物的方波伏安峰及峰电流.结果表明:酶催化反应前,底物在工作电极上于-0.488 V(vs.SCE)处有明显的还原峰,在酶催化反应后,在-0.584 V处出现一个更大的还原峰,电位负移160 mV,且峰电流明显增大.峰电流值(Ip)与修饰在Au-Pt/PAN/GCE电极上的HRP的含量在1.0×10-2～2.0×102μg·L-1之间呈线性关系,方法的检出限(3S/N)为3.0 ng·L-1.     

以1-萘胺为底物伏安法测定辣根过氧化物酶

提出了1-萘胺-过氧化氢-辣根过氧化物酶(HRP)伏安酶联免疫分析体系应用于HRP的伏安法测定.在pH 7.0的KH2>PO4-Na2>HPO4缓冲溶液中,HRP催化过氧化氢氧化1-萘胺生成电活性产物,在极谱仪上进行二阶导数伏安线性扫描,该产物在滴汞电极上发生还原反应,于-0.43 V(vs.SCE)左右产生一灵敏的还原峰.HRP浓度在3.0×10-7～5.0×10-5>g·L-1范围内与线性扫描峰电流的二阶导数值(△I"p)呈线性关系,检出限为2.5×10-7g·L-1.     

固定HRP酶的聚苯乙烯整体微柱在VC含量测定中的应用研究

结合整体微柱和固定酶技术,以自制的苯乙烯整体微柱构建了一种固定辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的整体微柱,确立了HRP的最佳固定条件,并用于蔬菜中维生素C(vitamin C,VC)含量的测定.采用碱性的Luminol-HRP-H2O2化学发光体系测定VC含量,在6 mg·L-1HRP酶和0.2 mL·min-1过柱速率下,VC浓度在1.0×10-9 ～1.0×10-7 mol·L-1范围内与化学发光强度呈良好的线性关系,检出限为1.76×10-7 g·L-1,相对标准偏差为3.57%,建立的固定HRP酶的整体微柱-化学发光检测方法可用于蔬菜中VC含量的测定,测定结果与经典碘量法所得数据一致,经加标回收法测得VC的回收率为98% ～103%.     

2-氨基-3-羟基吡啶-过氧化氢-辣根过氧化物酶伏安酶联免疫体系分析人血清癌胚抗原

以氮杂环化合物为电化学分析底物的2-氨基-3-羟基吡啶-H2O2-辣根过氧化物酶(HRP)伏安酶联免疫体系测定人血清癌胚抗原(CEA).HRP催化H2O2氧化2-氨基-3-羟基吡啶的酶促反应产物,在缓冲液中-0.36 V处产生一个灵敏的伏安还原峰,借助此峰可以测定游离的HRP,进而可用于以HRP为标记物的酶联免疫分析.对酶促反应条件和测定条件的优化反应条件为:以B-R缓冲液(pH 6.0)为反应介质,在10 mL总反应液中含有1.0 mL 0.2 mol/L B-R缓冲液、3.0 mL 8.0 mmol/L 2-氨基-3-羟基吡啶溶液以及1.5 mL 0.5 mmol/L H2O2溶液,反应温度37 ℃,反应时间30 min.最佳测定条件为:B-R缓冲液(pH 7.0)为支持电解质,在10 mL总测定溶液中含有5 mL上述总反应液、1.0 mL 0.2 mol/L B-R缓冲液.测定仪器条件:起始电位0.00 V,终止电位-0.80 V,电位扫描速度400 mV/s,滴汞静止时间7 s.在最佳的反应条件和测定条件下,新体系测定游离HRP的线性范围为4.0×10-4～1.0 μg/L; 对HRP的检出限为0.12 ng/L.新体系对CEA测定的线性范围为0.50～80.0 μg/L; 检出限为0.50 μg/L.为经典ELISA法的检出限的1/10.