酶体外定向进化(Ⅱ)文库筛选的方法及其应用

定向进化是改造蛋白质分子的一种有效的新策略,但其构建的文库非常大,待筛选的克隆常常多达10^5～10^10．同时在目的酶筛选中,至关重要的是找到高灵敏度、高选择性和高通量的筛选方法．居于此,文中综合评述在突变株分离、酶检测和信号探测等方面,目前的一些常用技术及其最新进展．     

豆豉纤溶酶的定向进化

为提高豆豉纤溶酶的药用价值,通过易错PCR方法对来源于Bacillus subtilis DC-12的豆豉纤溶酶DFE基因进行突变并构建突变体文库,利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA对突变体文库进行筛选.通过3轮易错PCR最终获得催化效率提高的突变酶mDFE3.序列分析表明突变酶mDFE3基因发生了6处碱基突变,其中4处突变发生氨基酸取代,2处为同义突变;通过swiss-model repository模拟突变酶mDFE3的结构,显示3个突变氨基酸位于回环结构上,1个位于α螺旋上;酶动力学测定结果表明突变酶mDFE3的Km值由0.58mmol/L降低至0.45mmol/L,突变酶mDFE3的催化效率(kcat)是野生型的2.57倍.     

酶体外定向进化(Ⅰ)突变基因文库构建技术及其新进展

介绍在酶体外定向进化研究中,几种常用基因文库构建技术及其应用方面的最新进展．同时介绍近年来．一些新开发的基因文库的构建技术及其应用情况．对目前几种主要方法的特色和缺陷进行讨论．     

酶体外定向进化(Ⅲ)展示技术及其应用

利用展示技术构建的蛋白质／多肽的突变体库，可以通过高通量进行高效地分析和筛选，因此特别适用于改造蛋白质．文中综述噬菌体、细胞表面、核糖体、mRNA等展示技术的原理和方法，以及其在酶定向进化中的应用．     

利用EvolvR系统对酶基因实现多窗口定向进化的研究

EvolvR系统是一种CRISPR介导的新型定向进化技术,本研究探索其在酶基因序列定向进化中的适用性以及突变效率,同时在此基础上扩大EvolvR的突变窗口长度.研究成功将4个能高效表达的单个sgRNA串联,并检测到靶向同一基因的3个不同靶位点.证明EvolvR具有在目标基因区域大范围制造突变的潜力,具有很高的应用价值....     

人工酶与定向进化的前沿与挑战

定向进化是在实验室环境中,在分子水平上模拟进化过程,得到具有期望特征的蛋白质的方法,目前已成为蛋白质设计改造的重要方法。定向进化不仅可以用于天然蛋白质的改造,也可以通过改造现有的酶,使其具有新的催化活性,从而构建人工酶。本文重点介绍工业生物催化、纳米酶设计和光催化3个方向的前沿成果,并讨论人工酶与定向进化领域存在的挑战和问题。     

豆豉纤溶酶纤溶活性的定向进化研究

通过易错PCR方法向来源于枯草芽孢杆菌DC-12的豆豉纤溶酶基因中引入突变并构建突变体库.利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA以酶活力为指标对突变体库进行筛选,通过三轮易错PCR最终获得一株酶活力提高的突变株M324.序列分析表明突变体M324酶基因发生了六处碱基突变,其中四处突变发生氨基酸取代,另两处为无义突变.通过SWISS-MODEL Repository模拟突变酶的结构显示,三个突变氨基酸位于回环结构上,一个位于α螺旋上.纤维蛋白平板法测定纤溶酶活,结果显示突变酶的比活力是野生型的2.44倍.     

用体外定向进化的方法对EPSPS合酶基因草苷膦抗性机制的研究

为了寻找EPSP合酶中某些与草苷膦抗性相关的位点,利用体外定向进化技术,对可变盐单胞菌HT7的EPSP合酶基因,荧光假单胞菌G2的EPSP合酶基因以及按植物偏爱密码子合成G2的EPSP合酶基因,进行DNA shuffling,通过EPSP合酶缺陷型菌株E.coil ER2799的功能互补筛选,获得了7个草苷膦抗性有较大变化的EPSP合酶突变体.     

酶改性技术研究

酶具有催化效率高、催化专一性强等显著特点,然而,酶的活力和稳定性往往不能满足应用的要求.为了改进酶的催化特性,笔者及其所在课题组20多年来长期进行酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化、酶定向进化等酶改性技术的研究,发现通过酶的改性,可以显著改进酶活力和稳定性.文中对笔者及其所在课题组在酶改性技术方面的研究成果和进展作了介绍.     

微生物酶资源的开发和利用(上)

概括介绍了微生物酶资源的开发和应用进展,内容包括世界和我国工业酶制剂生产概况,开发酶制剂新品种的重要性和有利条件,快速开发具有应用价值新酶的途径,微生物酶的应用方式和应用领域以及130余种微生物来源的酶在实际中的应用简况。     

一种基于构件重组建立超大容量DNA文库的方法

设计固定长度的随机序列,并在随机序列的末端加上共用接头作为标准构件,利用共用接头之间的互补连接,用重聚PCR的方法将标准构件进行随机组合,得到1个序列多样化的DNA文库。重聚优化的条件为:随机序列质量浓度18 ng/μL,重聚PCR退火温度27.8℃,终止引物浓度为随机序列浓度的1/40。文中方法的建立克服了目前突变体文库建立方法中强烈依赖起始基因的弊端,可以开拓更为广阔的序列空间。     

采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化

以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变.     

Evolution of Word-updating Dynamical Systems （WDS） on Directed Graphs

This paper continues the research on theoretical foundations for computer simulation. We introduce the concept of word-updating dynamical systems (WDS) on directed graphs, which is a kind of generalization of sequential dynamical systems (SDS) on graphs. Some properties on WDS, especially some results on NOR -WDS,which are different from that on NOR -SDS, are obtained.     

新疆蜗牛酶的研制

以野生蜗牛嗉囊为原料提取蜗牛酶产品,检测所含纤维素酶、淀粉酶的活性,对其蜗牛酶产品进一步测试,结果表明新疆蜗牛酶中的纤维素酶活力为450U/g淀粉酶为405U/g。验证了新疆蜗牛酶中纤维素酶的活力很高。