A NOVEL VARIANT OF HUMAN INTERFERON α1 GENE

A 520-base pair human IFN-α gene was isolated by PCR method twice from chromosome DNA of a Chinese (Han Nationality) fetal liver. The nucleotide sequences were determined. These two separately amplified DNA fragments shared the completely identical nucleotide sequence but possessed C and G at positions 410 and 541, respectively, which differ from those oflFN-α1 and IFN-αD previously described. Therefore the deduced amino acid sequence would have an Ala at position 114 and a Val at position 158. At all other sites it has the same amino acids as those in IFN-α1 and IFN-αD. We recommend that IFN-αD gene, IFN-αI gene and IFN-αI/158V gene found in our laboratory, be named IFN-αla gene, IFN-αlb gene and IFN-αlc gene.     

中国人ω1型干扰素基因的克隆、一级结构测定以及在大肠杆菌中的表达

采用聚合酶链反应(PCR)方法,从中国正常胎儿肝细胞染色体DNA中分离并克隆了人ω1型干扰素基因,测定了核苷酸全序列,表明原有争议的第88位密码子为GGA的核苷酸序列是正确的,因此该氨基酸为Gly。随后又利用PCR技术将所获的ω1型干扰素基因原始克隆改造成适于在大肠杆菌中表达非融合蛋白的结构形式,并以pBV220为载体在P_RP_L串联启动子控制下进行温控表达。表达产物的抗病毒活性达6.5×10~7单位/升菌液(O. D_600=0.75)。IFN-ω1不仅具有很高的抗病毒活性,同时在结构上与动物滋养层蛋白高度相似,而后者又是作为母体妊娠识别信号存在于多种动物体内的抗黄体退化蛋白,因此本文获得的这—ω1型干扰素基因及重组蛋白在理论和实际上都有进一步研究的价值。     

人胃癌细胞株转化基因的克隆和核苷酸序列的分析

本文用人胃癌细胞株BGC-823总DNA对小鼠及大鼠成纤维细胞进行转染。用分子杂交方法证明大鼠第二轮恶性转化细胞基因组中合有来自人胃癌的转化基因,它与存在于正常细胞中的原癌基因c-Ha-ras同源。以λ噬菌体EMBL 3为载体,构建大鼠第二轮转化细胞基因组文库,以人Alu重复序列和c-Ha-ras为探针,将人胃癌细胞转化基因Ha-ras从文库中克隆分离出。用M13——双脱氧法测定转化基因第一、第二外显子核苷酸序列。结果表明转化基因除了第一外显子中有一个碱基发生变化外,核苷酸序列与原癌基因完全相同。     

中国海南省恶性疟原虫P190抗原变异的研究

本文应用双脱氧末端终止法测定了我国海南省恶性疟原虫FCC1/NH株P190抗原基因的部分DNA序列,共计2103个碱基对。与该基因现有资料比较,我们发现了该虫株P190基因的以下特征:(1)在核苷酸第2323至2340位间有18bp长的片段缺失,此缺失正位于该抗原一个重要T细胞表位和T-E-X三肽重复序列处。(2)该基因属MAD20变异型,但从3′端5013位起转变为K1型序列,表明在该处发生了基因内重组。(3)在N端三肽重复区为高度变异区,但该基因却与MAD20型序列呈现高度同源性。(4)除了缺失和5个碱基点突变外,其余序列符合双态性变异规则。本工作为P190疟疾疫苗的发展提供了可靠依据。     

基于磁性微球的无标记化学发光端粒传感新技术

近年来无标记型DNA传感技术的研究已成为病原基因测定和基因疾病诊断等领域新的研究热点之一. 基于磁性微球分离和富集的方法, 建立了一种新型的无标记化学发光检测技术, 并成功地应用于特定序列DNA——端粒的检测. 首先采用dT₂₀修饰的磁性微球, 与连接有dA₂₀的捕获探针DNA杂交, 然后再与端粒进行第二步杂交反应. 磁性分离洗涤后, 利用端粒中富含的G碱基与3,4,5-三甲氧基苯乙二醛反应产生特异性化学发光, 从而实现特定序列 DNA——端粒的无标记检测. 实验结果表明: 该法具有操作简便、分析快速、灵敏度高、专属性好等特点. 目标DNA浓度在5×10^－9～1×10^－7 mol/L浓度范围内具有良好的线性关系, 相关系数为0.9918.     

水稻组蛋白H3基因和1.5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基基因的克隆和结构分析

本文从水稻(Oryza sativa,IR26)细胞核中分离出的几个基因,测定了它们的DNA核苷酸序列,并从水稻IR26基因组文库中筛选和分离到一个14.8kb的DNA片段,其中含有一个H3基因和另一个类似H3的假基因。DNA序列分析的结果表明:水稻H3基因的编码顺序有405bp长,其5′和3′端的非编码区则含有几个与一般真核基因或组蛋白基因共同的调控序列。水稻H3基因的密码子有一显著特点,密码子的第三个核苷酸98％为G和C,通过Southern转移分析,表明水稻二倍体基因组中大约有50个左右H3基因,从同一个水稻基因文库中,我们还分离鉴定到了rbcS基因,它编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的小亚基,水稻rbcS基因的顺序含有一个内含子,其位置与小麦的相同,水稻和小麦rbcS基因所编码的转移肽,其最初18个氨基酸彼此是相同的。     

氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ基因5′端上游DNA特异结合蛋白的研究

本文利用Southwestern blot法检测了CPSI基因5′端上游序列特异结合蛋白,结果发现,大鼠肝细胞核蛋白中存在109kD和74kD的DNA结合蛋白,Bal 31酶切序列缺失实验证明,109kD和74kD蛋白质的结合位点分别位于—38至—4bp及—113至—38bp区域,109kD蛋白质还与—480至—161bp区结合,但在大鼠脾及F26大鼠肝癌细胞中未被测出.109kD和74kD DNA结合蛋白可能是肝组织特异的CPSI基因结合蛋白,与肝细胞的分化及癌变有关。     

启东鸭肝癌中人HBV突变体(pDKHBV)的DNA序列

本文首次报道对启东鸭肝癌中存在的人HBV样DNA~([3])(pDKHBV)的全序列分析。本工作建立了pDKHBV的M_(13)重组克隆及亚克隆,并应用末端终止法测定了它的全序列。结果表明,它长3218bp,与鸭乙型肝炎病毒无关,而同人乙型肝炎病毒(HBV)基因组有91％以上同源性(其中与adw_2亚型有99.0％同源性),存在与HBV一致的4个开放阅读框架,并在Pre-S_1基因下游59个核苷酸,以及C基因3′端分别有1个和2个核苷酸的缺失,造成Pre-S_1基因第58个密码子、C基因第158个密码子出现终止信号,以及P基因第21个密码子起发生移码突变。以上结果表明启东鸭肝癌中存在adw_2亚型HBV的非复制型突变体。由于启东鸭肝癌高发且与人肝癌高发有相关性,提示HBV作为人和鸭肝癌共同病因的可能性。     

半合成人肿瘤坏死因子cDNA的构建及其在大肠杆菌中的高表达

本文报道从人基因文库中分离淋巴毒素(LT)基因的同时,克隆了肿瘤坏死因子(TNF)基因,这两个基因相距1.2kb.TNF基因有4个外显子,第4外显子编码TNF成熟蛋白157个氨基酸中的140个.将第4外显子切出一部分,再人工合成编码其余氨基酸的DNA片段,两者连接构成重组的人TNF(rhTNF)cDNA,并克隆在大肠杆菌表达载体中成功地得到表达.5 l罐发酵得菌体约20g/l,以L929为靶细胞测定细胞毒活性为10~6-10~7单位/ml.高压液相色谱仪分离纯化rhTNF,冻干后得白色粉剂.测定了这种rhTNF的氨基端的10个氨基酸序列,证明与天然的人TNF完全相同.纯度约为95％.     

一种新的蛇毒解离素同系物的分离

为发现新的具有生物活性的蛇毒蛋白,以我国华南地区富有的蝮蛇蛇毒为分离样品源,采用高效液相色谱,从中分离出一种新的解离素同系物———AHP-4,建立了快速分离纯化蛇毒蛋白的方法。结构确认的结果表明,AHP-4的相对分子质量为7 554 Da,是由一条多肽链组成的蛋白质,N-端第1~15位的氨基酸序列为GEECDCGSPANPCCD。经GeneBank protein-protein BLAST检索及人工检索,在已知蛋白质N-端第1~15位氨基酸序列中,未发现与AHP-4氨基酸结构完全相同的蛋白质。AHP-4 N端第1~5位氨基酸序列与5种解离素中的氨基酸序列具有高度同源性,表明AHP-4是一种新的解离素同系物。     

以2-氨基嘌呤为荧光探针研究双链DNA分子内电荷传递机理

2-氨基嘌呤(2Ap)是腺嘌呤的结构类似物, 经常作为荧光探针分子用以研究DNA分子内电荷传递过程. 设计并合成了一系列2-氨基嘌呤和鸟嘌呤核苷酸重复序列GGG之间不同距离的双链DNA分子, 利用时间分辨荧光光谱手段研究了2Ap的荧光衰减动力学以及给体(…GGG…)与受体(2Ap)间的桥体(I, 次黄嘌呤)长度变化对双链DNA电荷传递过程的影响. 结果表明, DNA分子的荧光探针分子2-氨基嘌呤的荧光动力学呈三指数衰减. 其中几百皮秒的组分来源于2-氨基嘌呤和鸟嘌呤之间的电荷转移反应, 当两者间的距离不大于2.4 nm时, 衰减速率随距离的指数函数而减小, 衰减因子b值为1.3 nm^−1; 当两者间的距离大于2.4 nm时, 荧光衰减速率随距离增加而加快, 说明电荷转移过程还与桥体次黄嘌呤I的多重复序列能量匹配有关.     

基于DNA聚合酶I的新型电化学传感器及其胰腺癌K-ras基因点突变检测

本文构建DNA聚合酶I的新型DNA电化学传感器,将捕获探针通过Au-S键固定于Au基底表面,与互补靶序列杂交至点突变前一个碱基,通过DNA聚合酶Ⅰ将dUTP-biotin连接在目标DNA的检测位点,再与avidin-HRP反应,而后测定在TMB溶液中的电化学特性. 结果表明,DNA电化学传感电极的检测电流值与K-ras突变型基因浓度（1.0×10^-15 ~ 1.0×10^-10 mol·L^-1）对数呈良好的线性关系,且灵敏度高,特异性较佳.     

计时电量法用于检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的研究

以氯化六氨合钌( [Ru (NH3)6]3+)为杂交指示剂,通过Au -S键的共价结合,将DNA探针固定在电极表面与互补靶序列杂交,构建了计时电量法(CC)检测急性早幼粒细胞白血病(APL)中PML/RARα融合基因的电化学DNA传感器,并通过对比杂交前后电量的变化检测互补序列及浓度.由于杂交前后与DNA链静电结合的[...     

基于纳米金胶标记DNA探针的电化学DNA传感器研究

以纳米金胶为标记物,将其标记于人工合成的5-端巯基修饰的寡聚核苷酸片段上,制成了具有电化学活性的金胶标记DNA电化学探针;在一定条件下,使其与固定在玻碳电极表面的靶序列进行杂交反应,利用ssDNA与其互补链杂交的高度序列选择性和极强的分子识别能力,以及纳米金胶的电化学活性,实现对特定序列DNA片段的电化学检测以及对DNA碱基突变的识别.     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

聚合酶链反应用于高效的基因改造

本文报道利用近年来发展起来的基因体外扩增技术——聚合酶链反应(PCR)进行高效的基因定向改造的结果。在构建新的EcoRI基因表达质粒时,为了在EcoRⅠ基因SD序列前改变一个碱基引入SalⅠ切点以缺失其启动子,同时将Glul44改造成Lys,我们回收分离pER101的1.5kb SalⅠ/PatⅠ片段作为模板,合成各带一个错配的两个25聚DNA片段作为扩增引物,利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增,结果经过30个循环,从约0.05μg模板DNA得到约10μg的0.49kbDNA。根据理论计算,扩增产物中突变片段占99％以上。用SalⅠ/BglⅠ酶切克隆入pUCl9 SalⅡ/BamHI,任意取两个重组子进行序列分析结果表明都发生了预期的突变。扩增产物已被克隆入pER304,使得EcoRl(Lys-144)基因置于PL下游以实现其控制的高表达。     

大豆花叶病毒NIb基因的cDNA克隆和序列分析

以大豆花叶病毒北京分离株(SMV-BJ)RNA为模板,随机六聚核苷酸为引物,合成cDNA。根据SMV-BJ外壳蛋白基因序列和国外已报道的SMV,WMV-Ⅱ的有关序列,设计寡聚核苷酸引物。通过聚合酶连锁反应,得到了SMV NIb基因的全长cDNA克隆,并测定了其全序列。所测SMV NIb基因序列与WMV-Ⅱ(USA)株系比较,其核苷酸同源性达80.3％,由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性达到91.3％。综合SMV-BJ基因组3′端非编码区、外壳蛋白基因和NIb基因的资料,我们认为:WMV-Ⅱ可能是SMV的一个西瓜株系。实验中发现一些含NIb基因的重组克隆在3′端区域有大的序列变异,并讨论了这种变异的原因。在完成基因拚接、改造的基础上,构建了SMV-BJ NIb基因的高等植物表达载体。     

电化学石英晶体微天平实时表征和定量检测短序列DNA

利用电化学石英晶体微天平(EQCM)这一灵敏的质量和电化学传感器测定特定序列DNA。应用自组装膜技术在压电石英晶振表面自组装一带羧基的α－硫辛酸单层膜,通过盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共价固化寡聚核苷酸为探针,用于测定与其碱基序列互补的DNA。实验中EQCM实时监测了α-硫辛酸的自组装过程、探针固化过程及其与cDNA杂交过程。定量得出了探针固化量及cDNA杂交量。在酸性、中性和碱性条件下,分别对固化和杂交过程进行表征,实验发现探针固化及DNA杂交都受pH影响,本文对此现象进行了解释。同时,利用染料Hoechst33258的电化学活性,使其与双链DNA嵌合,通过测量Hoechst33258的电化学信息进一步验证了DNA杂交关键步骤。     

鲤鱼线粒体URFA6L基因和tRNA~(Lys)基因的结构分析

鲤鱼线粒体URFA6L基因全长165个核苷酸,其结构同爪蟾URFA6L基因非常相似,它们的核苷酸序列间有68％的同源性.鲤鱼URFA6L蛋白共有54个氨基酸,它的组成成分极不寻常,几乎半数是属于5种疏水氨基酸(脯氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸).比较了5种脊椎动物URFA6L蛋白和酵母ATP酶亚基8的氨基酸序列,发现它们有一些相同的结构特点,推测脊椎动物URFA6L蛋白起着ATP酶亚基8的作用.我们还测定了鲤鱼线粒体赖氨酸tRNA基因的核苷酸序列,并绘制了三叶草形的二级结构.鲤鱼线粒体rRNA~(Lys)基因同两栖类和哺乳类的tRNA~(Lys)基因一样,有许多不同于细胞质tRNA~(Lys)基因的不寻常结构特点.比较了7种脊椎动物tRNA~(Lys)基因的核苷酸序列,发现最保守的部分是反密码环、第8和第9个核苷酸、可变区、反密码茎和氨基酸接受臂.最不保守的区域是D-环和T-环.这些结构特点可能反映了线粒体tRNA~(Lys)同线粒体核糖体有不寻常的作用方式.     

DNALB膜的AFM形貌观察

DNA分子本身所具有的独特性质使其在生物学、医学和遗传学等领域占有极其重要的位置 ,近年来 ,人们意识到利用 DNA作为模板剂建造具有特殊结构和功能的纳米材料的可行性 [1] ,如 Braun等 [2 ]将寡聚核苷酸连接在两个金电极之间 ,用 DNA分子作为模板剂生长出 1 2 μm长、直径 1 0 0 nm的银纳米线 ;Mirkin等 [3]将 3 和 5 端连有巯基的寡聚核苷酸与金纳米粒子结合 ,通过互补的碱基形成介观尺寸的组装体 ;Alivisatos等 [4]利用 DNA的特点 ,使其与之相连的金纳米粒子按预计的形式排布形成人造分子 .我们尝试利用 LB技术将 DNA分子复合到…