基于核酸侵入反应偶联PCR的粪便样本基因甲基化定量分析方法及用于结直肠癌无创筛查

从粪便中检测BMP3基因甲基化水平可实现对结直肠癌的无创筛查,但对检测方法的灵敏度与特异性要求很高。本研究将核酸侵入反应与实时荧光聚合酶链式反应(PCR)偶联,建立了BMP3基因甲基化检测方法,以ACTB基因作为参比基因,通过优化反应体系中探针浓度、Flap核酸内切酶与Taq酶用量,提高BMP3目标基因与ACTB参比基因的扩增效率至接近100%,实现了利用ΔCT法进行BMP3基因甲基化水平的相对定量,可对低至10 copies的甲基化BMP3基因进行检测,并可从非甲基化模板中准确定量0.01%的甲基化模板,非甲基化模板不产生非特异性信号,表明本方法具有极高的灵敏度与良好的特异性。将本方法用于16例结直肠癌患者、7例结直肠腺瘤患者及19例健康人粪便样本中BMP3基因甲基化检测,结果表明,有5例结直肠癌患者的粪便样本检出BMP3基因甲基化,2例结直肠腺瘤患者的粪便样本检出BMP3甲基化,健康人的粪便样本均没有检出甲基化,表明本方法可用于检测粪便样本中基因的甲基化水平,为临床开展基于粪便中基因甲基化检测的无创结直肠癌筛查提供了新方法。     

基于高效液相色谱的喹啉类药物对刺参DNA甲基化水平的影响研究

建立了高效液相色谱/紫外法测定刺参组织全基因组DNA甲基化水平的方法,并运用此方法对喹噁啉药物处理过的刺参样品DNA甲基化水平进行分析。色谱条件为:色谱柱为ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250mm;5μm);柱温为30℃;检测波长为280 nm;进样量20μL;流动相为甲醇-7 mmol/L乙酸铵(7∶93),流速为1.0 mL/min。5-甲基脱氧胞苷和脱氧胞苷的质量浓度在0.05~1.0 mg/L范围内时,线性关系良好,相关系数(r)均为0.999 9。5-甲基脱氧胞苷和脱氧胞苷的检出限均为0.05 mg/L,在加标浓度为0.05,0.25,1.0 mg/L时,回收率为90.4%~100.6%,批内、批间相对标准偏差均小于4%。采用CTAB法提取刺参组织DNA,酶解后进行HPLC测定,结果表明:喹噁啉药物处理过的组织样品DNA甲基化水平低于对照组,该类药物通过改变DNA甲基化水平而影响基因的正常表达,可能是其产生遗传毒性的一种机制,建立的方法可以很好地用于全基因组DNA总甲基化水平的检测。     

DNA甲基化检测研究进展

DNA甲基化可以在不改变DNA碱基序列的情况下改变基因活动和功能,影响基因印迹、细胞分化、细胞增殖、染色质重塑、胚胎发育等重要生命活动,是表观遗传的研究重点和热点。为了研究DNA甲基化的分布、状态以及调控机制,越来越多的DNA甲基化分析和检测技术已被开发。本文归纳了近年来的DNA甲基化检测方法,讨论了不同方法的优缺点,为未来深入研究DNA甲基化提供参考。     

液相色谱-串联质谱法测定生物样本全基因组DNA甲基化

建立了基于液相色谱-电喷雾串联质谱的分析方法,对生物样本中全基因组DNA甲基化水平进行定量测定.首先将DNA从生物样本中提取出来,将DNA片段酶解为单核苷,利用液相色谱-串联质谱测定胞嘧啶核苷和5-甲基胞嘧啶核苷的含量,从而计算出其全基因组DNA甲基化率.利用该法研究了暴露于全氟辛烷磺酸的L-02细胞、10例原发性肝癌病例血浆样本和10例对照血浆样本的全基因组DNA甲基化水平,得出了它们的总甲基化率变化的初步结果.本方法操作简单,具有很高的灵敏度和稳定性,为研究生物样本,尤其是临床上易得但DNA含量极低的血浆样本的总甲基化水平提供了思路.     

基于核酸探针的光学传感方法和细胞成像研究

许多疾病的特征在于各种生物分子表现出的异常活性,这些物质通常在细胞内外显示过表达现象,因此对其灵敏靶向识别可以提供诊断和治疗效用。由于基因诊疗和化学传感技术的发展,用于灵敏检测细胞内外生物化学物质的核酸探针突显优势。核酸探针可以在稳定进入细胞的同时,特异性地结合目标物质,通过光学方法检测或通过成像技术标识出来。本文综述了采用光学传感方法和成像技术,基于核酸探针检测生物分子的新进展。根据检测对象进行分类,概括分析了几个代表性体系:核酸序列、蛋白质和酶、化学物质和物理化学条件,并详细阐述其关键设计原理、灵敏度及样品检测等结果,同时指出了各类核酸探针的优缺点。     

固相纳米孔对核酸组装的“免标记、均相”表征和应用探索

随着核酸自组装领域的飞速发展,除了作为遗传信息的载体外,核酸成为了一种具有高操作自由度和无限可能性的功能材料.基于核酸自组装原理的DNA纳米技术凭借其强大的可编辑性已经广泛应用于生物传感、纳米材料工程、医学诊疗以及分子计算机等领域.纳米孔作为一种新兴的单分子分析技术具有高分辨、高通量、免标记等特点,近年来在基因测序、分子物理化学性质分析等领域展示出了极大的应用潜力.作为一种新型高分辨表征技术,纳米孔已经在DNA纳米技术研究中崭露头角,被用于原位追踪和分析核酸分子的自组装行为.另一方面,DNA纳米技术也为纳米孔传感所面临的技术瓶颈提供了更多样化的解决思路,如借助功能核酸(Aptamer或DNAzyme)和无酶扩增核酸分子线路实现纳米孔对待测物的特异性增敏检测.本专论旨在通过对近期纳米孔技术与核酸自组装的跨领域研究成果进行系统性回顾,总结并展望纳米孔传感领域内核酸自组装的研究进展,以期为单分子生物分析、信息检索、基因分型和临床诊断等领域提供新思路和新方法.     

单细胞核酸编码扩增成像分析

单细胞成像可在单细胞水平观测目标物位置、 确定目标物含量, 在生命科学与临床医学研究领域应用广泛. 核酸编码扩增技术利用特定分子反应将待测目标识别转化为核酸条码的扩增, 具有探针种类多、 易编程、 反应条件温和及信号放大效率高等特点, 在单细胞低丰度、 高灵敏、 多目标物成像中优势显著, 为理解细胞状态、 探索生命过程提供了新思路. 本文综合评述了核酸编码扩增在单细胞荧光成像领域的研究进展, 以目标物的编码方式为分类依据, 系统阐述了固定细胞原位成像和活细胞成像中不同目标物编码与扩增成像方式的区别, 并对活细胞成像中多重检测面临的问题以及未来发展前景进行了展望.     

甲基化辅助实时直接分析电离的机理研究

实时直接分析电离源(DART)已经广泛应用于固体、液体和气体样品的快速检测. 在使用DART对低挥发性化合物进行分析时, 样品衍生化是十分重要的. 四甲基氢氧化铵(TMAH)是强的瞬时甲基化试剂, 常用于GC-MS的分析中. 以人参皂苷及人参寡糖为例, 研究了它们在TMAH的辅助下在DART中发生甲基化及电离的过程, 并从凝聚相和气相的角度对电离过程中的甲基化机理进行了研究. 人参皂苷主要发生不完全和全甲基化, 人参寡糖的甲基化则随着糖链的增长以及羟基的增多由全甲基化主导转变为过甲基化主导. 结果表明, 凝聚相和气相的共同作用是质谱检测到甲基化及过甲基化样品分子的根本原因.     

基于核酸适配体的生物标志物检测方法研究进展

核酸适配体是指能与特定靶分子结合的寡核苷酸链。因其具有易修饰、易合成和低免疫原性等特点,作为生物传感器的靶向元件,已广泛应用于各种生物标志物检测技术中。本文综述了近年来基于核酸适配体的生物标志物的检测技术在癌症、心血管疾病、阿尔兹海默症、抑郁症等多个疾病领域的诊断研究进展,列举核酸适配体新兴技术的创新应用,以期为生物标志物的检测提供新思路,也有望为相关疾病的早期诊断和治疗提供参考。     

污染水产去甲基化表观遗传毒性EGFP评价方法

pEGFP-C3质粒经过体外人工甲基化处理后,被转染进入HepG2细胞以构建重组细胞株．以5-AZA为阳性去甲基化毒物与重组细胞共培养,通过亚硫酸氢钠测序法定量检测EGFP基因启动子区甲基化状态,通过实时定量PCR检测EGFP基因表达,借助流式细胞术和荧光摄片定量检测共培养细胞的绿色荧光强度,在DNA甲基化、EGFP基因mRNA表达、GFP蛋白等多个层次研究5-AZA染毒处理与其去甲基化能力和荧光表达改变的响应关系．对天津污染水产的去甲基化能力进行了实际样品测试．结果表明,5-AZA与重组细胞的DNA甲基化、基因表达、蛋白产物变化之间存在显著关联,具有较低的检出浓度和良好的重复性．天津污染海域的水产去甲基化能力较强．本文初步建立了一种污染物去甲基化表观遗传毒性评价方法．     

MicroRNA分析方法进展*

MicroRNAs（miRNAs）是一类对基因表达具有调控作用的非编码小分子RNA (18–23 碱基)。MiRNA在动植物中普遍存在,并且在动植物的生长、发育、分化和生殖等过程中发挥着重要作用。人类约30%的基因受miRNA调控,并且miRNA的表达水平与人类重大疾病密切相关。MiRNA的定量检测和表达分析对深入理解其作用机制、疾病的诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重要意义。MiRNA检测一般是基于核酸杂交和扩增原理,方法主要有Northern印迹、微阵列芯片、原位杂交、实时反转录聚合酶链式反应（PCR）、滚环扩增和基于共轭聚合物的检测等。随着miRNA在不同生物中的大量发现和对其功能的深入研究,miRNA的检测方法不断改进和完善,新的扩增、探针标记技术和检测技术不断被开发。本文综述了miRNA检测方法的研究进展,评述了各类方法的优缺点,并对miRNA检测的发展趋势进行了展望。     

核酸检测方法及其应用

本发明提供检测灵敏度比传统方法高．同时可准确且迅速地检测出靶核酸的核酸检测方法及使用该方法的基因检测试剂盒。将包含细胞的试料固定于支持体，以这样的状态在支持体上扩增核酸，并检测扩增的核酸。由于不从试料抽取核酸，可防止伴随核酸抽取过程的核酸损耗的检测灵敏度的下降。     

DNA羟甲基化测序技术

5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)是继5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)之后发现的第六种碱基, 已在多种哺乳动物组织和细胞中检出. 与5mC相比, 5hmC的含量更低, 但5hmC也具有非常重要的生物学功能. 已有的研究表明, 5hmC参与了染色体重新编程、基因表达的转录调控, 并在DNA去甲基化过程中发挥重要作用. 另外, 5hmC可能与特定肿瘤的发生密切相关, 有可能成为肿瘤早期诊断的生物标志物. 因此, 发展可靠、灵敏和准确的5hmC检测技术至关重要. 本综述针对DNA羟甲基化的检测及测序技术进行了简要介绍.     

基于核酸适配体的荧光法检测中药中赭曲霉素A

赭曲霉素A(OTA)是污染中药材的重要真菌毒素,严重影响中药材质量和用药安全.在小檗碱溶液中加入OTA和其核酸适配体后,处于随意卷曲状态的核酸适配体会被OTA诱导折叠成为G-四链体构象,使小檗碱的微环境发生改变,从而增强其荧光信号.基于此,本文以OTA核酸适配体为识别原件,小檗碱为荧光探针发展了一种无标记的荧光体系检测OTA.对主要影响因素,包括K+,Mg2,小檗碱和核酸适配体浓度进行了优化.在最佳实验条件下,小檗碱荧光信号变化值与OTA浓度在5～200 nmol/L范围内成正比,检出限5 nmol/L.该方法仅使用无标记的核酸适配体完成了OTA的检测,避免了对核酸适配体的繁琐设计和标记.方法 有较高的特异性,并成功应用于中药桔梗中OTA的检测,回收率在86.3％～105.6％之间.     

一种用于核酸高灵敏检测的液滴式数字聚合酶链式反应芯片

为了实现对核酸的高灵敏度检测,构建了一种新型的液滴式数字聚合酶链式反应(dd PCR)芯片.该芯片由产生液滴的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块和储存液滴的玻璃腔室构成.实验结果表明,该芯片可以在25 min内产生2×106个直径为20μm的微液滴(体积4.187 p L).利用该芯片定量检测了表皮生长因子受体(EGFR)基因第19号外显子,在DNA浓度为106~101copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9998);在浓度为106copies/μL的19号外显子野生型DNA中检测105~100copies/μL的突变型DNA,其检测敏感度可达到0.0001%.该方法在同一芯片上实现了液滴产生、核酸扩增和荧光信号读取的功能,在核酸绝对定量及痕量突变基因的检测中具有潜在应用前景.     

具有核酸分子"光开关"特性钌(Ⅱ)配合物的研究进展

钌（Ⅱ）配合物类核酸分子“光开关”探针性质稳定、无毒环保,可用于痕量核酸检测、基因序列分析及三链DNA检测、DNA图像研究及DNA动力学过程分析、基因损伤研究、基因转染材料研究、量子点生物效应研究及用作电化学探针。随着核酸及其相关分析研究的不断深入和适配子技术的迅猛发展,基于核酸和核酸分子“光开关”还可进行药物筛选、生命活性分子如ATP及蛋白质等的分析检测,具有简便、快速、灵敏、抗光漂白等特性。对生命科学基础研究、食品安全及医学诊断具有重要的理论意义。作者对近10年来核酸分子“光开关”探针研究进展进行了评述,引用文献55篇。     

框架核酸高通量检测芯片

构建了一种基于框架核酸的高通量生物检测芯片.利用超微量移液自动化平台,将包含框架核酸探针的液滴按照预设命令固定至生物芯片微阵列上,在探针捕获核酸靶标后利用集成的基因芯片扫描仪对芯片进行成像,通过分析荧光强度定量化分析靶标浓度.结果表明,此框架核酸芯片能够实现框架核酸探针的高通量制备, 24 h即可制备具有15万个点的微阵列,且点间距离的相对偏差W≤10%、荧光强度的变异系数CV=3.30%,具有较高的稳定性,远高于国家标准.此外,该芯片具备高灵敏度、可寻址的高通量生物分析能力,对核酸靶标的检测限可达100 pmol/L.随着多种探针技术的发展,生物检测微阵列技术在高通量生物分析领域展示出巨大的潜力.     

环介导扩增与石英晶体微天平快速检测核酸

建立环介导恒温扩增(LAMP)-石英晶体微天平(QCM)原位快速检测核酸的方法。将环介导恒温核酸扩增(LAMP)技术与石英晶体微天平(QCM)技术相结合,采用巯基化试剂分子组装方法,将LAMP反应体系中的4个引物之一固定于QCM电极上,在安装所述电极的QCM检测池中配置LAMP反应体系并进行环介导恒温核酸扩增,用QCM仪器在线原位检测频率变化,判断LAMP反应是否发生,进而判断体系中是否存在目标核酸特异基因。该方法检测核酸特异性强、灵敏度高,并且操作简便,有望发展成为快速筛查检测核酸的有效手段。     

hgcA/B基因介导的汞甲基化分子机制及其应用

作为一种强神经毒性物质,环境中的甲基汞(MeHg)主要由产甲烷菌、硫酸盐还原菌、铁还原菌等厌氧微生物产生,可通过水生食物链积累并作用于人体。汞甲基化基因hgcA/B明确以后,不仅扩大了可探知的汞甲基化微生物范围,也为汞甲基化生物分子机制的探索提供了新的方向。本文1)概述了hgcA/B及其表达产物HgcA、HgcB的预测结构和生物体内的汞甲基化分子机制,2)讨论了基于hgcA/B的环境汞甲基化研究进展,3)总结了现有hgcA/B研究存在的不足,4)对汞甲基化基因领域的研究方向进行了展望。     

检测核酸表观遗传修饰的测序方法

生物个体中的所有体细胞享有相同的遗传信息,但具有不同的RNA表达亚群和蛋白组,在特定的时间,实际上只有部分基因被表达并执行其功能.近年来,表观遗传学研究的突破在一定程度上帮助人们理解了基因表达的调控. DNA、 RNA和蛋白质这3类生物大分子在合成后都会进行化学修饰,这些修饰几乎涉及所有生物过程的调控.迄今,已经在DNA和RNA中分别鉴定出超过17种和160种化学修饰,对DNA和RNA修饰的各种生物学功能的研究兴趣推动了表观基因组学和表观转录组学前沿领域的发展.开发化学和生物学工具来检测基因组或转录组中的特定修饰是表观基因组学和表观转录组学研究的关键,本文综述了一些常见的核酸修饰的高通量测序方法,提出现有方法中的一些瓶颈以及可能的创新方法.