生物素-亲和素系统在压电免疫传感器中质量放大作用研究

生物素-亲和素系统(BiotinAvidinSystem,BAS)是70年代后期迅速发展起来的一种新型生物放大系统,具有高灵敏度、高特异性以及简便、经济、快速等优点,在现代生物免疫学领域中已得到广泛的应用^[1].     

链亲和素-磁性微粒的制备及其应用

通过物理吸附和共价作用机制, 制备两种链亲和素-磁性微粒, 即链亲和素-金磁微粒和链亲和素-氨基磁粒, 并对其在不同缓冲液中的稳定性进行研究; 采用酶抑制法测定两种链亲和素-磁性微粒对游离生物素的结合能力; 分别以紫外吸收和固相核酸杂交方法, 测定两种链亲和素-磁性微粒对生物素标记寡核苷酸探针的固定化容量及活性, 并与Dynabeads®M-270 Streptavidin进行比较. 结果表明: 通过物理吸附作用制备的链亲和素-金磁微粒, 适用于核酸杂交与检测常用的STE (Tris-NaCl-EDTA) 缓冲系统, 通过共价作用形成的链亲和素-氨基磁粒, 适用于STE和磷酸盐(PBS)缓冲系统; 1 mg链亲和素-金磁微粒和链亲和素-氨基磁粒对游离生物素的最大结合容量分别为4950和5115 pmol; 对生物素标记寡核苷酸探针(24 mer) 的结合容量分别为2839和2978 pmol, 测定结果均是Dynabeads®M-270 Streptavidin的6~7倍; 与FITC-标记互补寡核苷酸的杂交结果表明, 固定于链亲和素-磁性微粒表面的寡核苷酸探针保持了较好的生物学活性.     

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定氯胺酮

建立了检测氯胺酮的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA)。实验最佳测定条件:抗原包被浓度为2.0mg/L、氯胺酮单克隆抗体浓度为10.2mg/L,生物素化羊抗小鼠IgG(Biotin-IgG)和酶标链霉亲和素(SA-HRP)的最佳反应浓度分别为0.29和1.0mg/L。在此优化条件下,方法的线性范围为0.1～1000μg/L;检出限为0.03μg/L。氯胺酮生物样品的加标回收率为94%～102%。与酶标二抗体系ELISA法相比,BA-ELISA具有更高的灵敏度,适于低浓度氯胺酮的检测。     

微悬臂生物传感器检测生物素-亲和素相互作用

将生物素共价键合到微悬臂的硅表面, 利用微悬臂传感技术在流动注样条件下研究了生物素-亲和素的动态作用过程, 同时利用原子力显微镜(AFM)力刻蚀技术验证了生物素化硅表面结合亲和素的有效性. 结果显示亲和素与生物素作用产生较大的表面应力驱动微悬臂偏转, 悬臂偏转的程度和速率与亲和素的浓度相关, 亲和素浓度越大, 微悬臂偏转程度也越大, 同时反应速率也更快. 这项工作为开发新型的无标记检测技术, 研究生物分子之间相互作用提供了有益的探索.     

喷射式流动注射电化学发光免疫检测禽流感H9亚型

利用磁分离和生物素亲和素技术,形成亲和素化磁微球-生物素化抗体-抗原-钌标抗体的免疫夹心复合物,初步建立了体外免疫诊断试剂的制备方法,并利用喷射式流动注射电化学发光体系对制备出的禽流感病毒H9免疫复合物进行检测。实验选择最适的包被抗体,检测抗体和封闭剂,优化Ru标抗体的最佳稀释度。在生物素化的兔抗H9多抗作为亲和素化的磁微球的结合抗体,鼠抗H9单抗作为Ru(bpy)32+标记抗体,2%BSA作为封闭剂,1:50倍稀释的Ru-鼠抗H9单抗条件下,非特异性吸附最低。测定不同浓度的H9抗原,发现抗原浓度在3.125～100μg/mL范围内与电化学发光强度呈较好的线性关系。实验还测定了不同亚型的禽流感病毒、不同来源的毒株和鸡的棉拭子样品。     

实时生物分子相互作用分析技术用于链霉亲和素-生物素化抗体的层层组装研究

使用生物分子相互作用分析（Biomolecular interaction analysis,BIA)技术实时监测了在链霉素和素表面层层组装亲和素－生物素化抗体多层膜的过程，结果表明，通过链霉素和素与生物素之间的强亲和作用，能够在表面形成均一的多层膜，并用实时BIA技术求得了每层蛋白质的表面浓度，对于生物素化抗体，单层吸附表面浓度为1.32ng/mm^2；对于链霉亲和素，单层吸附表面浓度为2.93ng/mm^2。同时对蛋白质在表面的排列状态进行了探讨。     

生物素化高分子涂层的制备与评价

制备了一种能固载目标蛋白质, 却没有非特异性蛋白质吸附的高分子涂层. 该涂层是可生物降解的油水两亲性的三嵌段聚合物, 即生物素偶联的聚乙二醇-聚丙交酯-聚赖氨酸共聚物. 将高分子溶解于N,N-二甲基甲酰胺中, 并涂布在预先包被了聚赖氨酸的脱脂玻片基质上, 形成高分子涂层, 在其表面包被一层由明胶和聚N-乙烯基吡咯烷酮组成的封闭剂. 使用酶标免疫分析法, 对高分子涂层表面的生物活性进行评价. 依次将辣根过氧化物酶标记的链亲和素和生物素偶联的小鼠球蛋白抗原和碱性磷酸酯酶标记的马抗小鼠抗体固载在高分子涂层表面上, 通过标记酶与底物作用生色. 分析结果表明, 经过封闭以后, 生物素化的高分子涂层表面能够排斥非特异性的蛋白质; 同时特异性蛋白质之间(如生物素和链亲和素之间、抗原和抗体之间)的相互作用依然保留, 并且固定在表面的蛋白质依然保留其生物活性. 因此生物素化的聚乙二醇-聚丙交酯-聚赖氨酸三嵌段高分子可以作为生物活性材料, 用于蛋白质固载和蛋白质分离及分析.     

5,5'-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)功能化的SERS纳米探针在免疫检验中的应用

以5,5'-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)(DSNB)分子作为偶联剂将蛋白质结合在金纳米粒子表面,既保持了蛋白质的生物活性,同时DSNB分子又具有较高的表面增强拉曼散射(SERS)活性,可作为蛋白质定量分析的探针分子.选用生物素与亲和素的特异性识别以及抗原抗体的免疫识别2个生物反应体系,将SERS纳米探针固定在蛋白质检测芯片上.以硅片为蛋白质检测载体,利用硅片在520 cm-1处的拉曼特征峰为内标,对人Ig G抗体进行定量分析.结果表明,该探针对人Ig G抗体检测的最低浓度可以达到5 pg/m L.     

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚A

建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法,测得最佳实验条件为包被抗原浓度为13.8mg/L、抗体稀释为2.4×105倍,生物素化二抗和酶标亲和素的最佳稀释倍数分别为2000倍和500倍。在优化条件下,方法的线性范围0.2~1000μg/L;最低检出限0.05μg/L。所建立的方法用于食品和唾液中双酚A含量的测定,样品处理简单,结果满意。     

基于生物素-亲和素相互作用的胶体晶体阵列的构筑与特性

将胶体晶体阵列(crystalline colloidal arrays,CCA)的Bragg衍射特性与水凝胶的刺激响应性功能结合起来,可制成一种有效的对特定分子具有识别和响应能力的传感材料.采用无皂乳液聚合制备的单分散聚(苯乙烯-4-苯乙烯磺酸钠)纳米颗粒,通过表面电荷的静电斥力可自组装形成CCA,经光聚合固定在水凝胶网络内形成聚合胶体晶阵(polymerized CCA).在水凝胶网络中用共价结合引入生物素分子,通过强的亲和相互作用可与蛋白质亲和素生成生物素-亲和素复合物,在水凝胶网络中形成交联点,引起水凝胶体积相变,进而导致CCA晶面间距发生改变,从而引发Bragg衍射波长发生相应的移动.     

免疫亲和质谱法研究／β2-微球蛋白抗原表位

采用免疫亲和分离与质谱分析相结合的方法,对β2-微球蛋白抗原表位进行了系统研究.完整的抗原分子和已固定在载体(CNBr-activated Sepharose beads)上的单克隆抗体发生免疫亲和反应后,用Endoproteinase Glu-C,Trypsin,AminopeptidaseM和carboxypeptidase Y四种不同的蛋白酶依次酶解抗原分了,并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对与抗体连接受保护而未发生水解的肽段进行了研究.结果表明:β2-微球蛋白抗原表位位于整个蛋白分了氨基酸序列的61～67位,即为SFYLLYY.通过合成肽段的分析,证明了SFYLLYY即为抗原表位,与亲和质谱方法分析结果一致.     

基于生物素化纳米抗体检测拟除虫菊酯代谢物3-苯氧基苯甲酸的研究

该研究在前期已制备获得的拟除虫菊酯代谢物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）纳米抗体（Nb）基础上,将其进行生物素化,并利用多聚辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（polyHRP－SA）进行信号扩增,建立了基于生物素－亲和素系统高灵敏间接竞争ELISA检测3-PBA残留的分析方法。对抗原抗体工作浓度、缓冲液条件（pH值、离子浓度、吐温－20浓度）及polyHRP－SA浓度进行优化后,所建方法对3-PBA的半抑制浓度（IC50）为1.7 ng/mL,线性范围为0.37～7.4 ng/mL,检出限（LOD）为0.15 ng/mL。将该方法用于人尿样品（高温酸水解后固相萃取净化）和环境水样品（简单过滤）中3-PBA的检测,加标回收率分别为87.0%～127%和78.0%～113%,相对标准偏差（RSD）不大于10%。该方法具有灵敏度高、操作简便,适用于生物与环境样本中3-PBA的快速筛查。     

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定二乙基磷酸酯类有机磷农药

基于生物素和亲和素之间发生特异性反应,形成多酶系统,建立了二乙基磷酸酯类有机磷农药的竞争酶联免疫分析技术和生物素-亲和素放大酶联免疫分析技术.在优化条件下,二乙基磷酸酯类有机磷农药浓度在1×10-1～1×104 μg/L范围内与抑制率线性关系良好,其线性回归方程为y＝0.1168x+0.6259(r＝0.9889),半...     

γ-干扰素DNA传感器组装过程的表面等离子体子共振研究

自行设计并组装了一套简便实用的多波长表面等离子体子共振DNA传感装置,用于γ-干扰素DNA的检测。以人工合成γ-干扰素(interferongamma,IFN-γ)寡聚核苷酸片段作为DNA探针,用化学法标记生物素探针,利用生物素-亲和素系统相互作用在传感器表面固定DNA探针,使用该SPR传感装置实时监测了DNA探针的固定过程及DNA杂交反应的进行。用于IFN-γ寡聚核苷酸的检测,测定范围为50-400ng/mL;用于IFN-γ的聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增产物的检测,其测定范围为5-40ng/mL。同时研究了DNA传感器的稳定性、可逆性及干扰情况。实验结果表明,该传感器可成功地用于检测目的DNA。     

基于磁性纳米颗粒和金纳米粒子构建DNA电化学生物传感技术

本文构建了一种基于纳米粒子、茎环DNA和丝网印刷电极(SPCE)的电化学生物传感技术用于乳腺癌基因的快速、灵敏检测。该传感技术中,探针DNA的两端分别标记了巯基和生物素,巯基用于与金纳米粒子(AuNPs)作用,生物素用于与磁性纳米颗粒(MNPs)表面修饰的链酶亲和素作用以达到富集的目的,之后利用SPCE进行电化学检测。无目标DNA存在时,双标记DNA保持茎环结构,使得生物素分子很难和MNPs上的亲和素接触。一旦加入目标DNA,茎环结构打开,生物素得以与MNPs上的链霉亲和素发生特异性结合,形成的复合物(MNPs-DNA-AuNPs)通过磁性富集到SPCE表面,从而获得AuNPs的电化学信号。该DNA电化学生物传感对单碱基错配有良好的分辨能力,完全互补DNA的检出限为8.0×10-13 mol/L。     

生物素-亲和素体系测定雌酮

雌酮与牛血清白蛋白共价结合,合成雌酮的完全抗原。利用此抗原免疫小鼠,通过细胞融合技术制备了雌酮的单克隆抗体,经纯化表征知,抗体是IgG1型,相对分子量为164000,与固定抗的亲和常数为8.2×10^8L/mol。以生物素化的羊抗鼠免疫球蛋白及辣根过氧化物酶标记的链亲和素为标记体系,通过竞争抑制的方式测定游离的雌酮,结果表明：雌酮在10～10000pg/mL内呈线性关系。     

免疫亲和质谱法研究β2-微球蛋白抗原表位

采用免疫亲和分离与质谱分析相结合的方法, 对β2-微球蛋白抗原表位进行了系统研究. 完整的抗原分子和已固定在载体(CNBr-activated Sepharose beads)上的单克隆抗体发生免疫亲和反应后, 用Endoproteinase Glu-C, Trypsin, Aminopeptidase M和carboxypeptidase Y四种不同的蛋白酶依次酶解抗原分子, 并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对与抗体连接受保护而未发生水解的肽段进行了研究. 结果表明: β2-微球蛋白抗原表位位于整个蛋白分子氨基酸序列的61～67位, 即为SFYLLYY. 通过合成肽段的分析, 证明了SFYLLYY即为抗原表位, 与亲和质谱方法分析结果一致.     

基于碳纳米管载体的丙烯酰胺免疫亲和吸附剂的研究

自从在油炸及烧烤的淀粉类食品中检测到具有潜在致癌风险的丙烯酰胺副产物后,发展简单实用的丙烯酰胺检测方法的研究备受重视~([1]).以N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯(NAS)为半抗原,成功制备了对丙烯酰胺具有特异性识别和结合作用的多克隆抗体,建立了能够对淀粉类食品中丙烯酰胺进行快速检测的生物素-亲和素酶联免疫分析方法~([2]).     

基于生物素-亲和素系统的压电免疫传感器检测相思子毒素研究

利用生物素-亲和素系统的放大作用和纳米金质量扩增效应,建立了压电免疫传感器检测相思子毒素的新方法.首先在石英晶体的金电极上依次组装二巯基丙酸、EDC和NHS进行表面修饰,然后通过亲和素固定生物素标记相思子毒素多抗来制备敏感膜,利用纳米金的质量扩增效应设计了一种"毒素-纳米金标记单抗"复合物,成功实现了对相思子毒素的检测,提高了传感器灵敏度和重现性.本传感器对相思子毒素响应的线性范围为0.05～5 mg/L; 回归方程为Δf＝50.81CAbrin+67.11(r=0.9903,n＝10,P<0.0001); 检测灵敏度为50.81 Hz · L/mg.     

β2-微球蛋白连续表位的免疫亲和质谱研究

采用Endoproteinase Glu-C, Lys-C和Trypsin 3种蛋白酶分别水解β2-微球蛋白, 产生一系列肽段, 利用固定在琼脂糖珠上的单克隆抗体与其发生免疫亲和反应. 利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术, 对抗原决定簇肽段-抗体复合物进行系统研究, 结果表明, 与抗体结合部位即连续表位的位点为肽段(59~69)(DWSFYLLYYTE). 该研究方法简便、准确, 可用来对其它抗原连续表位的快速测定.