大豆花叶病毒NIb基因的cDNA克隆和序列分析

以大豆花叶病毒北京分离株(SMV-BJ)RNA为模板,随机六聚核苷酸为引物,合成cDNA。根据SMV-BJ外壳蛋白基因序列和国外已报道的SMV,WMV-Ⅱ的有关序列,设计寡聚核苷酸引物。通过聚合酶连锁反应,得到了SMV NIb基因的全长cDNA克隆,并测定了其全序列。所测SMV NIb基因序列与WMV-Ⅱ(USA)株系比较,其核苷酸同源性达80.3％,由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性达到91.3％。综合SMV-BJ基因组3′端非编码区、外壳蛋白基因和NIb基因的资料,我们认为:WMV-Ⅱ可能是SMV的一个西瓜株系。实验中发现一些含NIb基因的重组克隆在3′端区域有大的序列变异,并讨论了这种变异的原因。在完成基因拚接、改造的基础上,构建了SMV-BJ NIb基因的高等植物表达载体。     

人原发性肝癌及7402细胞株和髓细胞白血病细胞株(K562)的癌基因(转化基因)的共同属性——N-ras基因

用人的原发性肝癌(PHC)、肝癌7402细胞株(郭婵等,1984)及髓细胞白血病K562细胞株的DNA转染的NIH/3T3转化株DNA,以Southern吸印和~(32)P-标记的癌基因探针做分子杂交来分析,结果如下:在PHC DNA转化的NIH/3T3细胞DNA中,鉴定有N-ras基因的7.2及9.0kb(EcoRI酶切)的带,与人白细胞和肝癌DNA中出现的专一性条带相同,但是没有人Ha-ras(BamHI 6.6kb)或Ki-ras(EcoRI 3.0kb)的专一性条带。在以7402及K562细胞株DNA转化的细胞DNA中,同时发现有人的N-ras和Ha-ras基因(6.6kb,BamHI酶切),人的Ki-ras特异片段(3.0kb,EcoRI酶切)没有被检测到。PHC的DNA中N-ras基因在带型及杂交强度上没有大的改变,由于N-ras基因(非Ki-ras,Ha-ras)的表达,在多数PHC中明显地增加,提示了N-ras至少是人肝癌的转化基因之一。     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

胰泌素基因的化学合成和克隆

本文报道的内容为胰泌素基因的化学合成和克隆。胰泌素为一由2了个氨基酸组成的肠胃道多肽激素,该多肽合成基因的顺序由计算机辅助设计,共216个核苷酸碱基;合成基因选用酵母细胞偏爱的密码子,并在其中设置了一些便于今后用于基因改造、表达调控和产物分离所需的位点,排除了可能影响酶促连接反应的各种重复顺序;用化学法(固相磷酸三酯法和固相亚磷酸三酯法)合成了12个基因片段,长度为12寡聚核苷酸至24寡聚核苷酸,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化合成产物;利用T_4DNA连接酶组建完整的胰泌素基因,克隆于pWR 13质粒中,构建了一个含胰泌素基因的新质粒pWS 1。     

人卵巢癌耐药细胞株的比较蛋白质组分析

本文采用高分辨二维凝胶电泳分离技术对人卵巢癌细胞株COC1及其耐药细胞株COC1/DDP中的蛋白质进行分离和差异表达分析, 应用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对酶解多肽进行测定[即测定蛋白质的肽质量指纹图(Peptide mass fingerprinting, PMF)], 并通过相应的数据库搜索来鉴定蛋白质. 为获得更准确的检索结果, 采用串联质谱技术对各肽段进行氨基酸测序, 并应用IPI-HUMAN数据库对上述检索结果进一步加以确认.      

马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

克隆的乙型肝炎病毒核心抗原基因的起始密码上游序列对表达的影响

本文报道以双脱氧链终止法测定了乙型肝炎病毒(HBV)adw亚型不同表达水平克隆株中核心抗原基因(HBc)的核苷酸序列。结果表明,表达水平的差异主要是由于核心抗原基因起始密码上游核苷酸序列结构的不同所致。低表达克隆株中的HBc在起始密码前形成一个茎状的二级结构;高表达克隆株则在Bal-31外切酶的作用下,此结构被完金切除;中庋表达克隆株此结构的一半被切除。显然,二级结构的存在阻碍了核心抗原基因的转录和转译。从而降低了核心抗原蛋白在大肠杆菌中的合成量。     

adr亚型乙型肝炎病毒表面抗原基因的核苷酸顺序

本文应用化学降解法测定了adr亚型乙型肝炎病毒pADR-1 DNA中包含表面抗原基因(s基因)的XhaI BamHI片段顺序,共1279碱基对。比较了adr亚型与已知的adw,adyw,ayw的s基因的核苷酸顺序及其编码的HBsAg氨基酸顺序的差异,发现了一些新的变异位点,差异集中分布在HBsAg的亲水区域。但在一些可能具有生物功能的位点,各亚型间并无变异,在遗传和进化中是相对保守的。比较s基因区和非s基因区的核苷酸变异情况表明,非s基因区的变异频率高一倍,s基因区是相对保守的。     

核苷和核苷酸混合物的层析

本文介绍五个核苷和六个核苷酸混合物的反相柱层析。柱上用涂有N263固定相(它与聚三氟氯乙烯担体的重量比为1:1)的交换剂装填。以含有KCl的咪唑·盐酸缓冲液(pH7.0)分三级洗脱,除了3＇-T_p和3＇-A_p外,每一对洗脱成份的分离度都大于1。     

含双氢尿嘧啶核苷或核苷酸的低聚核苷酸的组成分析

在核酸化学研究中,核酸的组成分析已有报导,这些报导都是采用紫外检测法。1965年,Madison等人根据双氢尿嘧啶核苷(DHU_r)及其核苷酸(DHU_p)的水解产物尿代丙酸的衍生物能与对二甲氨基苯甲醛显色的特性,用纸层析证实了tRNA存在DHU_p.DHU。无明显特征紫外吸收峰,不能用通常的紫外吸收法检测。本文应用这个特性,报导了一种能用于含DHU_r或DHU_p的低聚核苷酸的组成分析方法。     

化学合成的亮氨酸脑啡肽基因在大肠杆菌中的克隆和表达

化学合成的亮氨酸脑啡肽(LEK)基因与质粒pBR322重组,转化大肠杆菌,经过原位杂交筛选,限制性图谱分析和Southern杂交鉴定,获得一批LEK基因重组体。插入乳糖操纵子(1ac)启动基因控制LEK基因的表达。一个lac转录方向和LEK基因转录方向相同的表达质粒,pLE103,能在大肠杆菌中产生LEK。用放射免疫分析方法检测,LEK的产量可达每毫克细菌蛋白426毫微克。     

黑麦和水稻与脯氨酸合成有关的基因片段的克隆和鉴定

用大肠杆菌营养缺陷互补法得到了含黑麦和水稻染色体DNA片段能互补于proA2~-的转化体.在渗透胁迫下,黑麦和转化体中这些片段的转录物都有明显增加,转化体中游离脯氨酸量也增加了.转化体的抗旱抗盐能力明显优于对照菌.初步分析,所克隆的片段和植物的调渗作用有关.     

水稻组蛋白H3基因和1.5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基基因的克隆和结构分析

本文从水稻(Oryza sativa,IR26)细胞核中分离出的几个基因,测定了它们的DNA核苷酸序列,并从水稻IR26基因组文库中筛选和分离到一个14.8kb的DNA片段,其中含有一个H3基因和另一个类似H3的假基因。DNA序列分析的结果表明:水稻H3基因的编码顺序有405bp长,其5′和3′端的非编码区则含有几个与一般真核基因或组蛋白基因共同的调控序列。水稻H3基因的密码子有一显著特点,密码子的第三个核苷酸98％为G和C,通过Southern转移分析,表明水稻二倍体基因组中大约有50个左右H3基因,从同一个水稻基因文库中,我们还分离鉴定到了rbcS基因,它编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的小亚基,水稻rbcS基因的顺序含有一个内含子,其位置与小麦的相同,水稻和小麦rbcS基因所编码的转移肽,其最初18个氨基酸彼此是相同的。     

人参叶全长cDNA文库的构建及部分克隆的序列分析

提取人参叶组织总RNA,用SMART[TM]cDNA文库构建试剂盒所示方法,以λTriplEx2为载体构建了人参叶cDNA文库.经测定该文库初始滴度为1.2×106pfu/mL,扩增后滴度为7.6×1010pfu/mL,重组率为86%.插入片段长度为0.3~2.5 kb.随机挑取16个cDNA克隆体进行测序分析,结果显示16个克隆体中有8个同GenBank中登录的人参皂苷合成相关基因GBR5,GBR3和GBR1高度同源,8个为新的基因序列.人参cDNA文库的建立为克隆人参中有明确功能的特异基因以及克隆和研究人参中的新基因奠定了必要的物质基础.     

中国人HCV基因组NS3区c33-c抗原基因cDNA克隆和在大肠杆菌中表达

本文通过逆转录(RT)-聚合酶链式反应(PCR)从一份来自山东省泰安市的丙型肝炎病毒(HCV)RNA打点杂交阳性的中国人血清中扩增并克隆到一段约850bp的HCV基因组NS3区c33-c抗原基因,测定该基因的全序列后发现,中国人HCV泰安分离株与HCV Ⅰ型株HCV-US和Ⅱ型株HCV-BK在该基因区段的核苷酸/氨基酸序列同源性分别为79.2％/91.3％和91.3％/93.9％。利用原核高效表达载体pBV220在大肠杆菌中有效地表达了非融合的c33-c重组蛋白,通过免疫筛选法及Western印迹法对约占菌体可溶性蛋白14％的表达产物进行了鉴定。采用Triton X-100和尿素处理表达产物后再进行离子交换层析,纯化得到可用于检测HCV血清抗体的c33-c抗原。利用该抗原与HCV核壳蛋白区的分支状合成肽一起组装成中国第二代免疫酶法(E1A)测定HCV抗体试剂盒,其检测特异性、灵敏度和精密性完全符合HCV诊断试剂的国家质控标准,已基本达到国际上第二代HCV E1A主流试剂的水平。     

淇河鲫生长激素(growth hormone)全长cDNA的克隆与序列分析

用RT-PCR法和3′、5′RACE(Rapid amplification of cDNAends)法从淇河鲫脑垂体RNA克隆出生长激素(Growth hormone,GH)cDNA.此cDNA全长1191 nt(含Poly(A)14 nt),其5′端非编码区长55 nt、阅读框(Open readingframe,OAF)长633 nt,3′端非编码区长503 nt.其推导的GH由210个氨基酸组成,其中氮端前22个氨基酸为信号肽部分.氨基酸序列比较表明:淇河鲫与同目的鲫鱼、鲤鱼、团头鲂和斑马鱼的同源性分别为98.6%,96.2%,91.5%和88.6%;与不同目鱼的胡子鲇和鳗鲡的同源性分别为74.6%和49.5%;与哺乳类的家鼠和人等的同源性低于40%.     

絮凝基因的克隆及其絮凝形态表征

分离出一株具有强絮凝特性的芽孢杆菌Bacillus sp. F2, 其絮凝率达到84%, 并构建了絮凝基因组文库, 从中筛选并获得表达絮凝活性的大肠杆菌阳性克隆子FC2. 絮凝试验测定FC2的絮凝率为90%, 稍高于原絮凝菌F2, 高于受体菌JM109(6.9%), 说明FC2絮凝性状遗传于原絮凝菌F2. 采用轻敲模式下的原子力显微镜成像技术、光学显微镜、ζ电位等对加入FC2与F2及不加入絮凝剂的絮凝微观形貌等进行了测定. 原子力显微成像显示, 加入克隆菌FC2发酵液的高岭土悬浮液形成的絮凝胶体出现大而紧密的球形颗粒结构, 且表面积粗糙, 凹凸程度大, 具有大的比表面积和吸附液体悬浮颗粒的能力. 向高岭土悬浮液中加入克隆菌FC2发酵液后, 絮凝颗粒由松散的不定形结构转变为密集分布、 水平尺寸均匀的球形结构, 表明克隆菌FC2发酵液中的凝集素容易以高岭土悬浮颗粒为中心吸附在其表面, 而且絮凝率达到90%, 进一步证实了克隆菌FC2发酵液的除污染效能. ζ电位测定结果表明, 离子键作用强度不同, 致使絮凝形态存在差异, 为研究生物絮凝剂的絮凝机理提供了有力的依据.     

人类基因组和DNA序列分析新进展

0世纪 90年代世界各国纷纷将人类基因组研究列为国家重大研究项目。很多人认为这是当代也可能是整个时代最重要的科学事业[1] ,因为它是全面揭开人类自身奥秘的划时代研究 ,对人类的生命和生存具有极其重大而深远的影响。1 990年美国制定了世界上最庞大的人类基因组项目 (Ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ) ,计划在 1 5年内投资 30亿美元 ,完成人类基因组全部脱氧核糖核酸 (ＤＮＡ)测序、定位及遗传学研究。由于计划庞大 ,人们称其为“人的阿波罗”计划。英国、日本和德国都有较大的人类基因组研究项目。我国在北京和上海分别建立了人…     

毕兹多克隆抗体的制备和分析应用

用琥珀酸酐－碳二亚胺法和氯磺化法合成了毕兹（Ｂｚ）的两种人工抗原Ｂｚ＿ＨＳ＿ｐｒｏｔｅｉｎ和Ｂｚ＿ＳＯ２＿ｐｒｏｔｅｉｎ。由Ｂｚ＿ＳＯ２＿ＢＳＡ（牛血清白蛋白）诱导出的抗血清能够用来测定１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１的Ｂｚ，工作曲线的线性范围在３×１０－５～３×１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１，相对标准偏差为１３６％（ｎ＝６），回收率在９０％～１１５％。     

人类和黑猩猩的回文序列的对称性分析

首次通过分析人类和黑猩猩的X染色体上的一条回文序列,来寻找这种对称性破缺的规律．分析结果表明,与红毛猩猩相比,尽管在人类回文序列上发生的突变总数比在黑猩猩上的少,但是在各自的序列上,它们的左臂的突变总数与右臂的突变总数都基本上是相同的,这意味着它们的回文序列的进化都是同步的．然而,在每个臂上,A／T→G／C的突变数目却大于G／C→A／T的,这表明回文序列的成分并没有达到平衡,并且GC含量有上升的趋势．此外,通过两臂之间的序列比较发现,发生在人类回文序列上的突变数目多于发生在黑猩猩上的突变数目,并且这种突变更容易发生在具有相似化学结构的碱基之间．因此,黑猩狠回文序列上的对称性看起来要比人类回文序列上的对称性高．