非肽类SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的设计与活性表征

SARS冠状病毒3CL蛋白酶是SARS病毒复制过程中的主要蛋白酶, 针对其开展药物设计有望得到有效的抗SARS病毒药物. 本文基于SARS冠状病毒3CL蛋白酶的三维结构, 对现有化学试剂及临床用药数据库进行虚拟筛选, 选出可能对SARS冠状病毒3CL蛋白酶有抑制的非肽化合物进行初步活性测试, 并研究了已知的人鼻病毒3C蛋白酶抑制剂对SARS冠状病毒3CL蛋白酶的活性, 合成了两种母环的衍生物, 得到靛红和哌嗪两类SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂, 其中一个靛红类化合物的IC₅₀为0.76 µmol•L^－1; 而抗组胺药哌嗪类化合物对SARS冠状病毒3CL蛋白酶及细胞培育的SARS病毒的抑制作用, 提示了老药可以开发出新的用途.     

SARS冠状病毒主要蛋白酶二聚体静电和疏水效应的研究

从三种冠状病毒主要蛋白酶SARS 3CL, HCoV 3CL和TGEC 3CL蛋白酶结构出发,着重研究了三种蛋白酶二聚体单体之间的静电和疏水相互作用.用连续介质模型有限差分方法计算得到三种蛋白二聚体界面处的静电势,发现三种蛋白酶单体和单体之间静电势分布具有明显的互补性,三种蛋白酶二聚体单体之间具有相同的静电相互作用能.用溶剂可及表面积模型分析了分子表面积及疏水性,发现三种蛋白酶具有相同的疏水分布,其中SARS 3CL蛋白酶疏水率为74%,驱动其单体聚合成二聚体.对三种蛋白酶的去溶剂化能疏水项的计算表明,三种蛋白酶二聚体单体之间具有相似的疏水相互作用能.     

静电和疏水效应对SARS冠状病毒3CL蛋白酶二聚体稳定性的影响

从TGEV3CL蛋白酶二聚体结构出发,研究了TGEV3CL蛋白酶二聚体单体之间的静电和疏水相互作用.蛋白质的静电相互作用通过有限差分方法求解Poisson-Boltzmann方程得到,疏水相互作用通过分析溶剂可及性表面模型得到.考察了不同pH值对SARS3CL蛋白酶二聚体静电和疏水相互作用的影响,在pH=5.5～8.5时,二聚体静电相互作用能、静电去溶剂化能和疏水自由能都具有较小的数值,表明在该条件下静电和疏水相互作用有利于二聚体的稳定存在.由于SARS3CL蛋白酶活性模式为二聚体,因此,在该pH值范围内,有利于蛋白酶保持活性.在pH=7.0条件下,蛋白酶单体之间具有最强的静电和疏水相互作用,从而使蛋白酶具有最强的活性,这与实验结果相一致.pH值对静电去溶剂化能的影响大于疏水自由能,表明静电作用是造成强酸或强碱条件下二聚体不能稳定存在的主要原因.     

SARS 3CL蛋白酶同源二聚化与底物结合互为别构调控因素

研究了严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒3C-Like蛋白酶(3CLpro)在存在底物或抑制剂时的二聚体形成情况. 通过测定酶活性随酶浓度的变化, 拟合出在底物存在下酶二聚体的解离常数约为0.94 μmol·L-1, 小于纯蛋白酶的二聚体解离常数(14.0 μmol·L-1), 表明底物对二聚体的形成具有增强作用. 选用与底物具有类似结合方式的靛红类抑制剂N-萘甲基靛红-5-甲酰胺(5f), 利用超速离心沉降速率方法定量测定了SARS 3CL蛋白酶单体和二聚体在不同浓度5f时的含量, 发现5f同样具有诱导二聚体形成的能力. 在3 μmol·L-1蛋白酶浓度下测定得到诱导二聚的EC50 值(半数有效浓度)约为1 μmol·L-1, 说明二聚体中只有一个单体与抑制剂结合. 研究结果表明, 随着底物浓度的升高, SARS 3CL蛋白酶会形成更多的二聚体, 而二聚体含量的提高又反过来提高酶的活性, 这种双向别构调控机制有可能是病毒用来调控多聚蛋白水解速率和组装时机的一种方法.     

3C-like蛋白酶抑制剂的构效关系、分子对接和分子动力学

3C-like蛋白酶是中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）等其它冠状病毒的繁殖过程中极为重要的蛋白酶。它已成为人类在抗冠状病毒领域中的研究热点。本文基于计算生物学方法对与MERS-CoV同属的蝙蝠冠状病毒HKU4（HKU4-CoV）的43个肽类3C-like蛋白酶抑制剂分子,建立三维定量构效关系（3D-QSAR）模型。在基于配体叠合的基础上,发现比较分子相似性指数分析法（CoMSIA）中的四个场组合（位阻场、静电场、氢键供体场与氢键受体场）为最优的模型（Q²=0.522,R_ncv²=0.996,R_pre²=0.904;Q²：交叉验证相关系数,R_ncv²：非交叉验证相关系数,R_pre²：验证集分子的预测值相关系数）,并借助该模型通过分子对接（docking）与分子动力学（MD）方法阐明了配受体结合作用。实验结果表明：（1）基于最优的CoMSIA模型基础上的三维等势图形象地说明了分子基团的位阻作用、静电作用、氢键供体与氢键受体作用对分子生物活性的影响;（2）分子对接研究结果显示了疏水性以及结晶水、氨基酸His166和Glu169在配体和受体结合过程中产生重要作用;（3）分子动力学模拟进一步验证了分子对接模型的可靠性,并发现了两个新的关键氨基酸Ser24与Gln192,它们与配体产生了两个较强的氢键。此外,根据这些结果,一些新的具有潜在抑制活性的肽类化合物作为3C-like蛋白酶抑制剂被获得。以上结果能够帮助深入了解3C-like蛋白酶与肽类抑制剂的作用机理,并且能够为今后的抗MERS-CoV药物设计提供有价值的参考。     

靛红类双功能抑制剂: 调控SARS-3CL蛋白酶聚集状态与活性

1-(2-萘甲基)靛红-5-甲酰胺类化合物通过与底物口袋结合来抑制SARS-3CL 蛋白酶的活性, 而SARS-3CL蛋白酶自身的N端8 肽是作用于蛋白二聚界面的抑制剂. 本文设计同时占据SARS-3CL蛋白酶底物口袋和二聚界面的双功能抑制剂, 通过固相多肽合成方法制备由1-(2-萘甲基)靛红-5-甲酸和N端8肽组成的化合物, 得到不同长度连接链的6 个目标产物. 用显色底物方法测定化合物对SARS-3CL蛋白酶的抑制活性,其中化合物3的活性最高, IC₅₀值(半抑制率)为3.8 μmol·L^-1, 连接偶数甘氨酸的活性明显要好于连接奇数甘氨酸的化合物. 用超速离心沉降速率方法研究了化合物3对SARS-3CL蛋白酶聚集状态与活性的调控作用, 其同时具有诱导与抑制二聚的双重能力, 综合调控结果是抑制SARS-3CL蛋白酶的二聚. 这项研究给应用合成的化合物研究酶活性调节机制提供了一个示例.     

新型SARS-CoV 3CL蛋白酶荧光多肽底物的设计、制备及其酶动力学研究

以邻氨基苯甲酸（Abz）为荧光发射基团、2，4-二硝基苯基乙二胺（rdanp）为荧光猝灭基团，设计合成了SARS，CoV3CL蛋白酶的新型荧光多肽底物：H2N-E（Eddnp）STLQSGLK（Abz）-CONH2．用液相色谱-质谱（LC—MS）联用技术进行了表征，表明该多肽底物能被SAILS-CoV 3CL蛋白酶识别，并在QS之间被专一性酶解．另外，利用该多肽底物的荧光共振能量转移（FRET）特性，对SARS—CoV 3CL蛋白酶的酶解动力学性质进行了研究，结果表明，此荧光多肽底物可以作为荧光探针，应用于SARS—CoV 3CL蛋白酶活性的测定及其抑制剂的筛选．     

金丝桃素分子结构及其与HIV病毒蛋白酶作用的分子动力学研究

采用用计算化学方法研究金丝桃素分子结构特征, 并用分子动力学方法研究其与HIV蛋白酶的相互作用, 探讨其可能的抗HIV病毒作用机理. 结果表明, 金丝桃素分子结构具有刚性特征, 与HIV蛋白酶在酶的催化活性位点与ASP-A25 and ASP-B25以氢键作用相结合.     

HIV蛋白酶抑制剂——利迪链菌素的分子对接研究

用分子对接的方法, 对利迪链菌素的抗HIV蛋白酶活性进行了研究. 为了更准确地反映利迪链菌素分子与酶蛋白结合的情况, 充分考虑受体活性部位的柔性, 采用了FlexX(初步对接)和Flexidock(精确对接)分两步将配体与受体进行对接. 在初步对接中, 设计了不同的受体活性部位来考察是否有结合水分子参与抑制剂与酶的结合. 对一种作用方式已知的非肽类HIV蛋白酶抑制剂Aha006进行的对接研究显示, 分子模拟的结果与实际情况吻合得较好, 证明了本文所采用的方法的可靠性. 利迪链菌素与蛋白酶活性部位的对接结果显示, 配体分子与受体之间的结合没有结合水分子的参与, 两者通过5对氢键作用结合成为稳定的复合物. 利迪链菌素占据结合腔, 覆盖了蛋白酶的活性三联体Asp25-Thr26-Gly27, 从而起到抑制其生物活性的作用.     

基于“底物包膜”假说筛选新型HIV-1蛋白酶抑制剂

基于“底物包膜”假说, 以现有HIV-1蛋白酶抑制剂Darunavir为模板构建药效团模型并对中药化学数据库进行搜索; 采用分子对接方法进一步考察化合物与HIV-1蛋白酶结合情况及其与“底物包膜”符合程度, 优先选出两个化合物Annomonicin和去乙酰蟾蜍它灵; 应用分子动力学方法对这两个化合物进行动力学模拟, 观察它们与蛋白酶结合的复合物在动力学过程中的稳定性并计算其结合自由能, 综合评价筛选结果, 最终确定化合物Annomonicin具有更潜在的深入研究价值.     

人类2-氨基3-羧基粘康酸6-半醛脱羧酶(ACMSD)与底物及抑制剂作用模型的理论研究

利用同源模建和分子动力学模拟方法构建了人类2-氨基3-羧基粘康酸6-半醛脱羧酶(hACMSD)的三维结构, 并利用Profile-3D和Procheck等方法评估了模型的可靠性. 在此基础上, 用分子对接程序(Affinity), 将其底物2-氨基3-羧基粘康酸6-半醛(ACMS)和抑制剂喹啉酸(QA)分别与hACMSD进行对接, 获得了复合物结构的理论模型. 通过配体与受体之间相互作用能和结构分析给出了底物和抑制剂的具体结合方式, 明确了hACMSD与底物和抑制剂结合时起重要作用的氨基酸残基.     

六钼酸盐有机胺杂化衍生物与SARS-CoV 3CLpro相互作用的分子动力学模拟

采用分子动力学模拟方法, 在分子水平上探讨六钼酸盐有机杂化衍生物潜在的抗SARS病毒活性. 3CLpro主蛋白酶是冠状病毒复制和转录过程中起关键作用的功能蛋白, 因此采用SARS-CoV 3CLpro作为靶标进行抗SARS病毒的药物设计. 使用Insight II软件包中的Biopolymer, Discover 3, Profile-3D和Affinity等模块, 研究 POMs/3CLpro相互作用的结合位点和作用性质. 研究其能量变化规律, 探讨了多酸化合物对SARS病毒可能的抑制机理. 研究结果表明, POMs与3CLpro在酶的催化活性位点处有较强的结合力. 形成的复合物主要以静电相互作用相结合, 氢键相互作用对复合物的相对稳定性有一定影响. 对于POMs/3CLpro复合物, 有机胺基团取代的POMs所带负电荷比未取代体系的高, 比3CLpro的结合能更高, 这与POMs的相关量子化学计算结果吻合.     

Design, Synthesis and Molecular Docking of a Novel Small-molecule Inhibitor of Caspase-3

4,5-Dihydro-3-methylbenzo[1,2-b]furan-4,5-dione(4) was identified as a novel and potent inhibitor of caspase-3 through structural modification of an existing drug,sodium tanshinone ⅡA sulfonate(STS).Compound 4 showed high potency against caspase-3 in vitro(IC50=0.13 μmol/L).Molecular docking study further provided an insight into the interaction of compound 4 with activated caspase-3.Hence,this small-molecule caspase-3 inhibitor could be a promising therapeutic candidate against diseases caused by abnormally up-regulated apoptosis.     

Discovery of Fuchsone Derivatives as Novel Nonpeptide Inhibitor of Caspase-3

Many degenerative diseases caused by uncontrolled cell death can be intervened pharmaceutically through inhibiting caspase-3 activity that leads to cell apoptosis. Here is presented the discovery of rosolic acid and phe- nolphthalein methyl ester, which both belong to fuchsone derivatives, as novel and potent nonpeptide inhibitors of caspase-3. They show high inhibitory potency against caspase-3 in vitro(IC50=0.28 and 0.13 μmol/L). Molecular modeling study provided further an insight into the interaction of phenolphthalein methyl ester with activated caspase-3. The structures of the present small-molecule caspase-3 inhibitors are different from the structures of known caspase-3 inhibitors, so the inhibitors were likely to provide some information for the discovery of anti-caspase-3 inhibitors.     

SARS病毒蛋白水解酶的三维结构模建及可能的小肽抑制剂研究

SARS病毒作为一种正链病毒 (Positive stranded RNA virus) ,其传播复制起重要作用的是其内部的 E蛋白、S蛋白、M蛋白、N蛋白、RNA聚合蛋白和蛋白水解酶 (Proteinase)等 6种蛋白质 .其中蛋白水解酶与 SARS病毒的复制密切相关 ,是抗 SARS病毒药物筛选的理想靶点 ,而它的三级结构则是研究病毒机理和进行药物设计的基础 .我们采用生物信息学的方法 ,利用 NCBI和 EBI提供在线蛋白质序列相似搜索工具 Blast和 FASTA3 ,找到同源性为 43 .791 %的 1 L VO(PDB编号 ) [1] ,并在 SiliconGranphics工作站上利用 Insight 的 Homology…