池蝶蚌金属硫蛋白基因的原核表达及活性分析

筛选池蝶蚌性腺转录组并运用RT-PCR方法扩增池蝶蚌金属硫蛋白(metallothionein,MT)ORF框序列。该序列有216个碱基组成,编码71个氨基酸,其中半胱氨酸含量丰富,富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys结构。多序列比对表明,池蝶蚌MT蛋白序列和其他物种MT序列有很高的同源性,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)MT蛋白具有100%的同源性。将该ORF框片段导入原核表达载体pET-32a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为27kDa,在25℃,终浓度为1mM IPTG诱导4h表达量最高,重组蛋白主要存在上清液中,纯化并获得了重组蛋白。细胞增殖实验表明,纯化的MT融合蛋白有生物活性并能有效地减轻宫颈癌Hela细胞的氧化胁迫效应。     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP7O基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列.用半定量PCR方法研究了HSP70 mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况.结果表明:HSP70cDNA全长为2664 bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1917 bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3 kD.HSP70基因不含内含子.氨基酸序列分析发现,推导的氨基酸序列含有HSP70家族的3个标签序列(I10 DLGTTYS17,V198 FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKV QK350).氨基酸序列同源性比较显示HSP70与紫贻贝(Mytihcs galloprovincialis)和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)氨基酸序列同源性分别为79.47％和77％.半定量PCR分析显示在正常褶纹冠蚌血液、外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺5种组织中均能检测到HSP70的基因表达.经过热休克或病原菌刺激后,蚌各组织中HSP70 mRNA的表达显著增加,其中热休克处理后,蚌的鳃和血液中HSP70 mRNA表达量增加最为显著;而嗜水气单胞菌刺激后蚌的肌肉和鳃组织中HSP70 mRNA表达量增加最明显.     

设计和鉴定花生主要过敏原Ara h 2低致敏原衍生物

构建序列重新组合的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。将Ara h 2基因进行合理的缺失和重排,并将重排后的基因T-Ara h 2克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;再用IPTG诱导其表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western-blotti     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP70基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列。用半定量PCR方法研究了HSP70mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况。结果表明:HSP70cDNA全长为2 664bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1 917     

苏云金芽胞杆菌AiiA蛋白对魔芋软腐病菌的抗病活性

AiiA蛋白通过破坏病原菌的信号分子来阻断病原菌的群体感应调节系统,达到抗病的目的,是一种新型的抗病蛋白.根据蜡状芽胞杆菌ATCC14579基因组中aiiA序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌中成功扩增出aiiA基因,其ORF为753bp,测序后经blast检测与已发表的序列相似性均在95%以上.将此基因克隆到pET28a表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,超量表达的蛋白在菌体中以包涵体形式存在,纯化的AiiA蛋白经SDS PAGE电泳检测,表达产物分子量为28×103,致病性测定表明该蛋白对魔芋软腐病菌CZY具有较强的抗病活性.     

重组大肠杆菌中NTA的发酵与表达优化

研究诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间、锌离子以及在发酵培养基中组合添加乳糖对提高重组新型溶栓酶外源蛋白的表达效率的作用,结果表明：IPTG诱导效果优于乳糖,IPTG诱导浓度选择1．5mmol·L^-1,诱导时机选择菌体OD600接近4．0时,诱导后的最佳培养时间为6h,加入1．0g．L^-1的ZnCl2后,外源蛋白表达可提高40％,发酵结果提高29．8％．在培养基中组合加入微量的乳糖,可以使外源蛋白的表达效率提高10％~15％．     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

三种草坪草愈伤组织的诱导及其脱水处理后的蛋白分析

研究了匍匐翦股颖、高羊茅和狗牙根3种草坪草愈伤组织诱导情况,愈伤组织诱导率分别为53．0±8．7％、60．7±7．9％和14．7±4．0％,三者的愈伤组织含水量约为91．4±0．3％、94．1±0．4％和93．4±0．2％．经空气干燥法脱水处理,两种冷季型草坪草匍匐翦股颖和高羊茅愈伤组织中18．5kDa和28．7kDa的热稳定蛋白表达量增加．暖季型草坪草狗牙根中18．5kDa的热稳定蛋白表达量增加,而35kDa的热稳定蛋白表达量明显减少．经脱水蛋白的Western Blot检测,脱水处理后3种草坪草中均有脱水蛋白大量积累,分子量从18．5到34．3kDa不等．暖季型和冷季型草坪草在热稳定蛋白和脱水蛋白表达上存在的差异,可能与它们的耐旱机理及耐旱性强弱差异有关．     

严重烧伤诱导大鼠心肌细胞内质网应激反应

观察严重烧伤大鼠心肌细胞内质网应激蛋白表达的改变及其意义,以探讨严重烧伤后心肌损伤与内质网应激的关系.将大鼠脱毛后于92 ℃水烫18 s,造成30%Ⅲ度烫伤(烧伤组)模型;牛磺酸治疗组大鼠在烫伤后即刻腹腔注射2%牛磺酸液(200mg/kg体重),其它操作与烧伤组相同.烧伤组和牛磺酸治疗组均于伤后1、3、6、12和24 h检测.对照组于37 ℃水浴18 s,1 h后进行检测有关指标.结果显示烧伤组大鼠伤后3h血浆中cTnT含量即呈显著升高(P＜0.01),心肌中GRP94 mRNA和蛋白表达于烧伤后3 h显著性升高,12 h达峰值,24 h还呈显著升高;伤后12 h心肌细胞Caspase-12 mRNA表达明显高于对照组;牛磺酸治疗组GRP94的表达和Caspase-12 mRNA表达量较烧伤组均有显著性降低(P＜0.05).结果表明严重烧伤可诱导心肌细胞内质网应激.     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.     

坛紫菜hsp70基因克隆与表达

HSP70家族是一类最保守和最重要的热应激蛋白家族,在藻类中编码HSP70家族的基因也是普遍存在的,从原始单细胞藻到多细胞的大型藻,hsp70基因在藻类适应环境的过程中起了重要的作用.为了进一步探讨hsp70基因的生物学作用及其在系统进化中的保守性,研究采用简并PCR,扩增获得了坛紫菜(Porphyra haitanensis)hsp70基因片段,随后利用基因组步移获取了坛紫菜hsp70基因全序列.该基因全长2449个碱基,其中1866bp为编码区域,共编码621个氨基酸,与同属紫菜(P.purpurea)hsp70的氨基酸一致性达90%以上.利用Real-time PCR技术研究热激及恢复过程中坛紫菜hsp70的表达情况,结果表明:坛紫菜hsp70对热激应答极为迅速,35℃热激15 min,hsp70 mRNA的表达就提升了15倍;在恢复培养3 h后坛紫菜hsp70的表达进入第二个高峰,表达量提升了48倍,且在随后的过程中始终高于对照值.在整个热激处理中,坛紫菜HSP70蛋白除了作为胁迫的应激蛋白外,始终作为重要因素参与了防御与损伤修复的过程.     

抗幽门螺杆菌尿素酶B纳米抗体的制备及鉴定

制备抗幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）尿素酶B（UreB）纳米抗体。用灭活的全幽门螺杆菌免疫羊驼,以重组蛋白UreB为靶分子,从噬菌体展示文库中筛选出能与重组蛋白UreB特异性结合的纳米抗体,构建原核表达载体,IPTG诱导表达,ELISA鉴定纳米抗体特异性。获得5×107cfu的噬菌体文库,将筛选的两个OD450值较高且序列不同的纳米抗体HU2-9和HU2-36分别进行表达SDS-PAGE鉴定均为可溶性且表达量分别为92和32 mg·L-1。ELISA结果表明两个纳米抗体能特异性结合Hp菌体蛋白,并对尿素酶活性具有一定的抑制作用。成功淘选出6种独特序列的抗幽门螺杆菌UreB纳米抗体。     

棉铃虫乙醇脱氢酶的表达规律

乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)是一种在醇类代谢途径中起重要作用的脱氢还原酶.为了深入了解ADH对棉铃虫CYP6B6的调控,基于酵母单杂交的实验结果,采用RT-PCR的方法从六龄幼虫的中肠cDNA中扩增得到棉铃虫乙醇脱氢酶5(HaADH5),构建重组菌株BL21-p ET32a-HaADH5,IPTG诱导表达后通过镍柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测目的蛋白的表达和纯化结果,实时定量PCR检测棉铃虫不同发育阶段和组织中HaADH5的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下六龄幼虫中肠组织内HaADH5的变化规律.结果表明,克隆得到的HaADH5大小为1 002 bp,编码334个氨基酸,预测的蛋白质分子量和等电点分别是36.5k D和6.55.氨基酸序列分析表明HaADH5蛋白不含信号肽和跨膜结构域.HaADH5在大肠杆菌BL21中主要以可溶蛋白形式存在,Western blot结果显示融合蛋白His-HaADH5的大小与预期一致且纯度较高.HaADH5在棉铃虫的所有组织中都表达且中肠内表达量最高,在幼虫的所有龄期都表达且预蛹期的表达量最高.2-十三烷酮处理后HaADH5的表达量降低,且10 mg/g处理组中HaADH5和CYP6B6随着时间的延长表达规律相一致.本文将为后续利用HaADH5作为分子标记来研究棉铃虫蜕皮和变态发育过程奠定基础.     

猪瘟病毒NS3蛋白的原核表达纯化和抗体制备

以猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA克隆pT7SM为模板,PCR扩增CSFV ns3基因N末端截短的cDNA片段.PCR产物经限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切消化后,克隆到经BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-ΔNS3,转化E.coli BL21-codonPlus (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达.采用SDS-PAGE分离纯化非结构蛋白3(NS3)重组蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体.ELISA法及间接免疫荧光检测结果显示,该多克隆抗体效价在1×105以上,能分别与在大肠杆菌中表达的NS3重组蛋白或CSFV感染细胞中表达的NS3天然蛋白发生特异性结合反应.制备的NS3重组蛋白可用作建立NS3抗体ELISA检测方法的包被抗原 ;NS3抗体可用于检测CSFV病毒感染和NS3功能研究中的蛋白质鉴定.     

人新型肿瘤坏死因子在E.coli中的 高效表达、纯化及诱导凋亡活性

采用PCR技术获得了新型的人肿瘤坏死因子基因,在153位氨基酸处引入突变,使Gly突变为Leu.将突变体hTNF基因克隆到表达载体pQE30中,SDS-PAGE结果显示经IPTG诱导后,hTNF基因获得大量表达.通过Ni金属鳌合层析柱亲和层析获得到纯化的hTNF融合蛋白,Westernblot结果表明hTNF蛋白可与抗TNF的抗血清发生特异性反应.荧光染色实验检测了hTNF蛋白诱导细胞发生凋亡的活性.     

重金属对褶纹冠蚌Cu/ZnSOD基因mRNA表达和酶活性的影响

为研究重金属离子对褶纹冠Cu/ZnSOD基因mRNA表达和酶活性的影响,采用Cd2+,Cu2+和Pb2+单一胁迫褶纹冠蚌72h,检测0,6,12,24,48和72h,Cu/ZnSODmRNA表达和酶活性的变化。结果表明:在Cd2+胁迫下,Cu/ZnSODmRNA表达量及酶活性均随暴露时间延长而逐渐升高,72h达到峰值,且48和72h均显著性高于对照组(P<0.05);在Cu2+胁迫下,Cu/ZnSOD mRNA表达量及酶活性具有先升高后降低的趋势,12h两者达到峰值,其中,Cu/ZnSOD mRNA表达量在12h显著高于对照组(P<0.05),Cu/ZnSOD酶活性在6,24,48和72h的表达量均显著高于对照组(P<0.05);Pb2+胁迫与Cu2+胁迫趋势相似,Cu/ZnSODmRNA表达量及酶活性均在48h达到峰值,Cu/ZnSODmRNA表达量在24,48和72h显著性高于对照组(P<0.05),Cu/ZnSOD酶活性在48和72h的表达量均显著高于对照组(P<0.05)。说明褶纹冠蚌内脏团中Cu/ZnSODmRNA和酶可以作为生物标志物对水环境中的重金属污染进行检测。     

假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法根据GenBank上登录的假结核耶尔森菌侵袭素蛋白核酸序列设计引物,用PCR方法扩增假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因,并将其插入克隆载体pMD18-T中,测序鉴定正确后再将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-inv.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测.结果假结核耶尔森菌提取的基因组,经PCR扩增,得到一段591 bp的片段,与预期结果一致;SDS-PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约46 kDa,与预期结果相同;重组菌体超声裂解后,经12%的SDS-PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为包涵体蛋白.结论克隆的侵袭素基因核心片段可以在原核细胞中高效表达.     

p16蛋白对B型流感病毒诱导HeLa细胞凋亡的影响

以流感病毒 B/沪防 93- 1株感染 He L a细胞 ,通过 Hoechst332 5 8荧光染色、琼脂糖凝胶电泳分析检测细胞凋亡 ,并用免疫组化技术测定 p16蛋白的表达 ,探讨 p16蛋白表达对 He L a细胞凋亡的影响 .结果表明 ,B型流感病毒感染 He L a细胞可诱导其凋亡 ,感染 2 4h后 ,细胞凋亡数达 84.5 % ;He L a细胞凋亡伴随 p16蛋白的表达 ,2 4h达高峰 ,阳性率为 49.2 3± 1.70 .研究结果提示 ,B型流感病毒感染诱导 He L a细胞凋亡过程与 p16基因激活相关 ,p16蛋白可能是介导流感病毒诱导细胞凋亡的另一重要途径 .     

B组轮状病毒WH-1株nsp2基因的原核表达与抗体制备

根据B组轮状病毒(GBRV)WH-1株nsp2基因的全序列,设计引物,用PCR的方法扩增得到nsp2基因的编码区.将其片段克隆到原核表达载体pGEX-KG上,经IPTG诱导,在E.coliDH5α菌株中得到高效表达.表达的GST融合蛋白大小为61×103,经SDS-PAGE分离纯化,免疫小白鼠制备了多克隆抗体.抗体经1∶3 000倍稀释后用于Western Blot分析,获得特异性显色信号.所表达的蛋白和制备的抗体可用于蛋白结构和功能的进一步研究.