介体型乳酸脱氢酶生物传感器的研制及应用

本报道了能对丙酮酸产生良好响应的电流型乳酸脱氢酶生物传感器。该传感器以耐尔兰Ａ修饰浸石墨电极为基体电极，将酶直接固化在蚕丝蛋白膜上。在ＰＨ７．４的ＮａＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ介质中，当２．４×１０＾－４ｍｏｌ／Ｌ的辅酶Ｉ（ＮＡＤＨ）存在下，该传感器的响应电流与丙酮酸浓度在３．２×１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ范围内有良好的线性关系。响应时间为６０ｓ．本讨论了影响传感器响应的各种因素，用此传感器测定了人血清中     

乳酸脱氢酶的流动注射分析—电化学检测体系的研究

本文研究了L－乳酸盐＋NADLDH／→/←丙酮酸＋NADH＋H^ 的酶反应动力曲线及NADH的电化学性质与流动伏安检测法，建立了乳酸脱氢酶（LDH）的单泵单液路流动注射分析－电化学检测体系，可测定LDH的活性和浓度。     

脱氢酶电化学生物传感器的研究进展

自然界中超过400种脱氢酶使用辅酶-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)作为生物催化反应中氢和电子的传递体,因此烟酰胺型辅酶的电化学氧化对构筑此类脱氢酶电化学生物传感器具有重要的意义.本文介绍了还原型辅酶在人工电子媒介体存在下的电化学氧化,以及脱氢酶电化学生物传感器的设计和应用.     

流动注入式乳酸生物传感器

研制了一种测定L－乳酸的生物传感器,将乳酸氧化酶（LOD）通过共价键固定在尼龙钢上制备乳酸氧化酶膜,将制得的酶膜固定在氧电极上构成乳酸生物传感器;将透析膜放在氧化酶膜上产生对L－乳酸扩散高度限制来改变该生物传感器的响应;酶膜机械强度高,在氧电极上反复装卸而不损坏,所构成的乳酸生物传感器的校正曲线的乳酸定量上限达5mmol/L,响应时间小于30s;初步血样测试的结果显示该乳酸生物传感器用于临床血乳酸的测定具有可行性。     

新型乳酸固定化酶荧光毛细生物传感器

对长45 mm、内径0.9 mm的医用毛细管进行γ-氨丙基三乙氧基硅烷氨基化和戊二醛醛基化后,再将乳酸脱氢酶(LDH)的氨基与戊二醛的醛基结合,使其固定在毛细管内壁,构成一种新型固定化酶乳酸荧光毛细生物传感器(IE-LFCBS),实现了对乳酸的微量、快速测定.IE-LFCBS吸入辅酶Ⅰ与乳酸的混合液,在固定化酶催化下使乳酸与辅酶Ⅰ反应,生成荧光物质还原型辅酶Ⅰ;激发波长353 nm、发射波长466 nm.适用于IE-LFCBS的优化条件为:辅酶Ⅰ浓度4 mmol/L、用于固定化的LDH浓度60 kU/L、反应时间15 min、反应温度38 ℃、测定范围为1.0～5.0 mmol/L、回收率95%～98%,IE-LFCBS的相对标准偏差为RSD<1.5%(n=11),检出限为0.45 mmol/L.IE-LFCBS的试液用量极少(18 μL),并能重复使用,可望用于发酵食品、药品、血液标本等各类样品中乳酸的快速检测.     

乳酸氧化酶共价交联于蛋膜上制备乳酸传感器

以牛血清白蛋白 戊二醛为交联剂 ,将乳酸氧化酶固定于鸡蛋膜上 ,氧电极作电化学敏感元件 ,制成乳酸氧化酶电极。传感器的线性响应范围为 5 .0×1 0 - 5～ 2 .5× 1 0 - 2 mol/L ,检测限为 2 .0× 1 0 - 5mol/L ,RSD为 1 .4% (n =1 1 ) ,回收率为 97.5 %～ 1 0 4 .0 %。该传感器可用于临床乳酸的测定。     

L-乳酸脱氢酶催化反应机理的理论研究进展

介绍Ｌ－乳酸脱氢酶可逆催化氧化Ｌ－乳酸生成丙酮酸的反应机理研究的最新进展。讨论底物及活性中心附近残基的构型对反应的影响以及Ｈ－离子转移的可能机理。     

光纤生物传感器用于核酸的特异性检测

为了利用光纤传感器实现对细菌核酸分子的特异性和相对快速检测，我们使用直径1mm的石英光纤和635nm激光二极管，利用倏逝波原理制作了光纤生物传感器。光纤经过处理后产生醛基化基团，然后与核酸分子进行共价结合。通过3个实验来验证传感器的特异性和灵敏度。蒌光素溶液直接检测，使用互补模式寡核苷酸分子（25mer)进行核酸杂交模式实验和设计嗜肺军团菌一段特异性探针一 光标记嗜肺军团菌染色体DNA杂交。结果表明：光纤检测荧光素的灵敏度可达0.01mmol/L，而生物芯片扫描仪最低可检测到1nmol/L的荧光素；模式寡 核苷酸杂交表明：光纤传感器可以特异地检出目的核酸分子，灵敏度可达纳克级水平；染色体杂交结果显示在正常检测浓度下，光纤检测军团菌之信噪比达到了6：1，同时具有较好的特异性。检测时间约需要3－4h。我们构建的光纤生物传感器可以用于核酸分子的特异性检测，并且具有较好的灵敏度，对光纤表面修饰、样品处理和杂交过程的优化可望使之应用于实际标本的检测。     

基于碳纳米管修饰电极的脱氢酶传感器研究进展

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)是目前已知300多种脱氢酶的辅酶,通过对NADH的检测,可以间接测定底物浓度或酶活力。如何利用电化学技术实现NADH的准确、快速、稳定检测,一直是电化学及生物传感领域的重要课题。碳纳米管(CNT)的发现为NADH的电化学检测注入新的生机。本文综述了近年来碳纳米管修饰电极在NADH电化学检测及脱氢酶生物传感器构建中的应用进展,并展望了其应用前景。     

Amperometric Biosensor for Lactate Based on Meldola's Blue Adsorbed on Silica Gel Modified with Niobium Oxide

A reagentless amperometric biosensor sensitive to lactate was developed. This sensor comprises a carbon paste electrode modified with lactate dehydrogenase (LDH), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD⁺) cofactor and Meldola's blue (MB) adsorbed on silica gel coated with niobium oxide. The amperometric response was based on the electrocatalytic properties of MB to oxidize NADH, which was generated in the enzymatic reaction of lactate with NAD⁺ under catalysis of LDH. The dependence on the biosensor response was investigated in terms of pH, supporting electrolyte, ionic strength, LDH and NAD⁺ amounts and applied potential. The biosensor showed an excellent operational stability (95% of the activity was maintained after 250 determinations) and storage stability (allowing measurements for over than 2.5 months, when stored in a refrigerator). The proposed biosensor also presented good sensitivity allowing lactate quantification at levels down to 6.5×10^?6 mol L^?1. Moreover, the biosensor showed a wide linear response range (from 0.1 to 14 mmol L^?1 for lactate). These favorable characteristics allowed its application for direct measurements of lactate in biological samples such as blood. The precision of the data obtained by the proposed biosensor show reliable results for real complex matrices.     

酶荧光毛细管分析法测定微量血清中乳酸脱氢酶活性

基于丙酮酸/还原型辅酶I/乳酸脱氢酶(LDH)/乳酸/氧化型辅酶I荧光猝灭体系和荧光毛细管分析技术,建立了可用于微量样品中LDH酶活性测定的方法。优化的测定条件为:激发及发射波长分别为350和460nm;测定温度为25℃;酸度为pH 6.5;NADH浓度为300μmol/L;丙酮酸浓度为1.2mmol/L。本方法的测定范围为50～1500IU/L,检出限为30IU/L,相对标准偏差2.1%～2.2%(n=10),回收率在96.4%～105%范围内。本方法操作简单,每次测定仅需样品2.0μL、试剂18.0μL,分析速度约为30样/h,利用本方法测定了微量血清中LDH的活性。     

固定化乳酸脱氢酶活性的X射线微区分析

利用X射线微区分析，对吸附法得到的固定化乳酸脱氢酶的活性进行了分析；以乳酸为底物，铁氰化钾及铜离子作为捕捉剂，底物经乳酸脱氢酶及氧化型辅酶NAD^ 的作用下催化产生丙酮酸，反应生成的还原性辅酶NADH使铁氰化物还原为亚铁氰化物，后者和铜离子反应产生具有高电子密度的亚铁氰化铜沉淀，可以确定固定化乳酸脱氢酶的催化活性部位；结果表明，以合成出的大孔吸附树脂为固定化酶载体，其酶活性较高，活性乳酸脱氢酶分布较均匀，得到了固定化乳酸脱氢酶的活性定位的最佳条件，并对不同结构载体固定化酶活性进行了研究。     

微流控芯片上同工酶的孵育及活性检测

建立了一种在微流控芯片上进行同工酶孵育及活性检测的方法. 该方法在集成温控装置的微流控芯片上实现对同工酶与辅酶反应进程的控制, 完成同工酶的进样、孵育反应、电泳分离和活性检测的实验步骤. 建立了基于微流控芯片的同工酶荧光检测系统, 使用360 nm光源激发辅酶产生荧光, 在460 nm处选择性采集荧光信号. 在微流控芯片上实现了同工酶样品的快速活性检测, 酶活性检测限达到0.5 U/L.     

A Fiber Optic Lactate Biosensor with an Oxygen Optrode as the Transducer

Abstract

A biosensor for continuous determination of lactate is presented. Lactate monooxygenase was immobilized covalently on nylon membranes, and the consumption of oxygen was measured by following, via a fiber optic bundle, the changes in the fluorescence of an oxygen-sensitive dye dissolved in 10- and 25-um silicone membranes placed beneath the enzyme layer. Oxygen is consumed as a result of the oxidation of lactate by the enzyme, and the decrease in its partial pressure is indicated by the fluorescent dye. For two types of sensors (with different nylon membranes and different thicknesses of the indicator layer) the analytical ranges were 2–50 mM and 0.3–6.0 mM, with response times (t₉₀) of 2.3–3.0 and 4.0–6.0 min, respectively.     

Lactate Biosensor Based on the Adsorption of Polyelectrolyte Stabilized Lactate Oxidase into Porous Conductive Carbon

 In this work the development a lactate biosensor is illustrated. Lactate oxidase is stabilized with the cationic polyelectrolyte diethylaminoethyl-dextran, and the resulting enzyme-polyelectrolyte complexes are physically absorbed into a highly porous and conductive carbon electrode for the construction of the biosensor. The amount of diethylaminoethyl-dextran used is optimized with respect to the sensor sensitivity and stability. Optimum results obtained with enzyme solution containing 0.5% w/v diethylaminoethyl-dextran and 200 U/ml lactate oxidase. The resulting biosensors present increased operational (over 240 hours of continuous polarization) and storage stability (more than 5 months), while the reproducibility was calculated to be better than 5.0% RSD.     

尼古丁对乳酸脱氢酶活性的影响

用计时电流法成功地研究了尼古丁对乳酸脱氢酶活性的影响,测定了尼古丁存在与否对乳酸脱氢酶酶促反应的初速度V0、酶促反应最大反应初速度Vm及米氏常数Km。实验结果表明尼古丁对乳酸脱氢酶的活性有很大影响,但在高浓度的NADH存在下,尼古丁对乳酸脱氢酶活性的影响将得到大大降低。     

Immobilization and Characterization of Lactate Dehydrogenase on TEOS Derived Sol-Gel Films

Physical adsorption and physical entrapment techniques have been utilized for the immobilization of lactate dehydrogenase (LDH) on tetraethylorthosilicate (TEOS) derived sol-gel films. The enzyme (LDH) activity has been assayed as a function of time, temperature, pH and pyruvate concentration. The results of photometric measurements used for monitoring the reaction yield a response time of about 1 min, linearity over a concentration range of 0–1.5 × 10^-3 M and detection limit of 5 × 10^-5 M. The TEOS sol-gel films containing LDH have been found to be stable for about 30 days at temperatures 4 to 10°C.     

反胶束固定化乳酸脱氢酶的催化动力学性质研究

以十六烷基三甲基溴化铵(CATB)-辛烷-己醇反胶束体系对乳酸脱氢酶(LDH)进行固定化,试验了含水量、CTAB和己醇浓度对LDH固定化的影响。对游离酶和固定化酶的催化动力学性质研究表明:酶促反应的最适pH值分别为9.2和9.5,最适温度分别是37℃和43℃,对乳酸的米氏常数Km分别为1.4 mmol/L和2.3mmol/L。30℃时,游离酶存放2 h,约失活50%,而固定化酶仅失活10%,表明反胶束固定化LDH具有较好的热稳定性。     

壳聚糖固定化乳酸脱氢酶的制备及酶学性质研究

以磁性壳聚糖作为载体,戊二醛作为交联剂,对乳酸脱氢酶(LDH)进行固定化.固定化的最适条件为:戊二醛浓度6%,pH值7.5,酶的偶联时间2 h.对游离及固定化LDH酶学性质的研究表明,酶促反应的最适pH值为9.2,最适温度分别为37℃和50℃,对乳酸的表观米氏常数分别为1.6 mmol/L和0.9 mmol/L.游离酶和固定化酶在40℃放置150 min后,其活力分别为最初的56.5%和76.1%.固定化酶在4℃贮存4周后,活力仍保留50%以上.固定化酶在室温下与底物重复反应6次后,活力仍保留60%以上,说明固定化酶具有较好的热稳定性、贮存稳定性和复用性.