纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰

多肽组是指生物体表达的所有多肽,尿液等体液的多肽组是生物标记物的重要来源.本研究采用氧化石墨烯-磷酸镧纳米磁性复合材料分离富集尿液多肽,进行纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析,从单一样本中鉴定了归属于123个蛋白质的790条肽段.研究表明,这些肽段在蛋白质水平上不是平均分布的.此外,本研究检测到了肽段的氧化、磷酸化和脱氨化等翻译后修饰现象,观察到了尿液多肽的阶梯序列性,从蛋白水平上对尿液多肽组进行了生物信息学分析,结果表明,这些多肽所归属的大部分蛋白质之间存在相互作用.本方法可为在尿液中寻找疾病的标志物提供方法学支持.     

纳升液相色谱-高分辨串联质谱研究冻存条件对唾液多肽组的影响

唾液多肽组学为疾病相关的生物标记物研究提供了新方法,但冻存条件对分析结果的影响并不清楚。本研究采用氧化石墨烯-磷酸镧纳米复合材料分离富集唾液多肽,利用纳升液相色谱-高分辨串联质谱技术,考察唾液样品分别置于-80℃与-20℃冻存6个月后对唾液多肽组的影响。结果表明,在-80℃冻存条件下的唾液样品中,共鉴定出归属于33种蛋白的429条肽段;在-20℃冻存条件下的唾液样品中,鉴定出595条肽段,对应31种蛋白。实验结果表明,相比于-80℃,唾液置于-20℃条件下的新增加肽段主要来源于已有肽段的降解,并且唾液中的蛋白质也发生了一定降解。本研究在肽段序列水平上考察了冻存条件对多肽的影响,结果表明,-20℃冻存条件不适合长期保存用于多肽组分析的唾液样品。本研究结果可为相关医学研究提供借鉴。     

肝移植后人血清中差异表达蛋白质的纳升超高效液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定

建立了基于质谱的人肝移植后血清中差异表达蛋白质的分析方法,肝移植前后的人血清蛋白质用双向凝胶电泳分离,AgNO3染色,差异蛋白质斑点用胰蛋白酶进行胶内酶解后,采用纳升超高效液相色谱-电喷雾串联质谱进行鉴定。鉴定了8个显著差异表达的蛋白质,Mascot检索分值101~1543分,肽段匹配数5~34个,序列覆盖率10%~43%。所发现的差异蛋白质多与免疫调节有关,可为深入研究肝移植术后免疫排斥的分子机理提供线索。     

比较纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱用于自顶向下蛋白质组学

自顶向下蛋白质组学的一个重要难题是缺乏与质谱可以在线连用并且可以提供高效蛋白质分离的液相分离技术。毛细管区带电泳与纳升反相色谱都可以与质谱在线连用,并且在复杂蛋白质样品分析方面也都有了显著的提升。在这里,我们首次比较了先进的纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱平台用于自顶向下蛋白质组学分析。相对于纳升反相色谱-质谱而言,毛细管区带电泳-质谱可以将标准蛋白质样品的消耗量降低10倍,而且保持与纳升反相色谱-质谱相当的蛋白质信号强度。有意思的是,与毛细管区带电泳-质谱相比,纳升反相色谱-质谱可以获得更高的蛋白质分子的气相价态。这个现象可能是由于反相流动相中的高浓度乙腈使得蛋白质变性的更加充分。从1微克的大肠杆菌蛋白质样品中,毛细管区带电泳-串联质谱可以鉴定到159个蛋白质和513个蛋白质变体,而纳升反相色谱-串联质谱仅鉴定到105个蛋白质和277个蛋白质变体。当将大肠杆菌蛋白质的上样量提高到8微克时,纳升反相色谱-串联质谱可以鉴定到245个蛋白质和1004个蛋白质变体。由于纳升反相色谱-串联质谱具有比毛细管区带电泳-串联质谱更高的上样量与更宽的分离窗口,当蛋白质样品量不受限制时,纳升反相色谱-串联质谱具有明显的优势。但是,在痕量样品分析方面,毛细管区带电泳-串联质谱具有更大的潜力。     

在线微柱富集纳升液相色谱-串联质谱法测定大鼠脑组织中类固醇激素

类固醇激素对脑功能的调节越来越受到人们的关注,但其在脑组织中极其微量而且脑组织样品量相对少,这对检测方法提出了更高的挑战。本研究优化了脑组织中提取类固醇激素的预处理方法,发现乙醇的提取效果最好。经过固相萃取柱进一步纯化的样品,基质干扰明显减少。采用75μm内径的C18捕集柱和分析柱,通过阀切换连接,构建了在线微柱富集纳升液相色谱分析系统,结合纳喷离子源串联质谱法实现高灵敏检测脑组织中类固醇激素。系统考察了方法的精密度、定量曲线、回收率等分析特性。日内和日间精密度分别在4.5%～12.8%和8.3%～20.3%之间。除了孕酮略有离子抑制外,其它激素基质效应不明显,而且低、中、高3个浓度下的回收率基本都在60%～115%之间。不同类固醇激素的检出限差异较大,在0.02～10μg/L之间。与常规尺寸液相色谱-质谱系统相比,相同进样量下,该方法的灵敏度显著提高了57～714倍,同时流动相消耗量降低了几百倍。将本方法用于大鼠脑组织中类固醇激素的检测,检测到4种类固醇激素,分别为睾酮(Testosterone)0.47 ng/g,肾上腺酮(Corticosterone)26.2 ng/g,醛甾酮(Aldosterone)0.49 ng/g和皮质醇(Hydrocortisone)0.06 ng/g。本方法具有灵敏度高、样品需要量少和溶剂消耗少等优势,可用于生物组织样品中类固醇激素的测定。     

血清多肽组及其个体差异的纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析

分析和比较疾病组及健康对照组的混合样品是血清多肽组生物标记物研究的常用方法,但对健康个体多肽组的差异和共性关注较少.本研究利用纳升液相色谱-高分辨四级杆飞行时间质谱鉴定健康人混合血清样品(20例)的多肽组,阐明血清多肽组的分子量分布等一般特征,进而选取6例个体样品单独分析并与混合样品的分析结果进行比较,说明正常健康样品之间的个体差异和共同成分.结果表明,可鉴定序列的血清多肽组的分子量范围在7000 Da以下,纤维蛋白原α链等蛋白质所属肽段的检出频率最高,肽段在蛋白质水平上分布具有不均一性,排在前10％的蛋白质占据了约50％的总肽段,而后40％的蛋白质只有1条检出肽段.此外,在所有样品中都检测到了来自于8个蛋白质的12个共同肽段,检测到了N端乙酰化、氨基酸氧化、磷酸化、脱氨化和脱水等翻译后修饰和明显的阶梯序列现象.本研究在肽段序列水平分析了血清多肽组的基本特征和个体差异,可为血清多肽组生物标志物研究提供参考.     

纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析锦灯笼提取物中的蛋白质

通过水提、酸沉法得到锦灯笼果实提取物,其中蛋白质含量为188 mg/g(以提取物干重计),共含有18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸占氨基酸总量的31%。基于鸟枪法蛋白质组学的分析方法,用纳升级反相液相色谱-串联质谱(nano-RPLC-MS/MS)系统分析锦灯笼果实提取物中蛋白质的酶解产物,结合数据库检索,共鉴定得到60种蛋白质;通过生物信息学分析,得到锦灯笼提取物中的蛋白质具有催化活性、抗氧化活性、酶调节活性、养分贮液囊活性、运输活性、结合活性六大生物活性,其中鉴定到与抗氧化相关的蛋白质有3种,为锦灯笼中蛋白质的功能性质的进一步研究奠定了基础。     

液相色谱-串联质谱快速测定烟草中18种氨基酸

建立了液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)快速测定烟草中18种游离氨基酸的分析方法。结果表明,18种氨基酸的检出限(S/N=3)为0.5×10-4~0.1mol/L,线性相关系数均大于0.9990,峰面积测定的相对标准偏差(RSD)为0.42%~8.09%,低、中、高3个添加水平的平均回收率为90.0%~106.0%。该方法准确、灵敏,可用于烟草样品中氨基酸的分析检测。     

纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析蜈蚣提取蛋白质

结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱-串联质谱(nanoRPLC-MS/MS)法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为:上样8μL,经Chrom XP-C18毛细管柱(350μm×0.5 mm,3μm),2%乙腈(0.1%甲酸)-98%乙腈(0.1%甲酸)梯度洗脱90 min;采用ESI-Q-TOF MS,并在IDA采集模式下分析鉴定蜈蚣提取蛋白质。胶内酶解鉴定到72种蛋白质,直接酶解鉴定到97种蛋白质,二者含26种相同的蛋白质。通过数据库比对,分析了蜈蚣提取蛋白质的生物进程、细胞组分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白质具有结合、酶催化、肌动等功能活性,其中结合活性的蛋白质占的比例较大,且多为能量代谢进程中的相关酶类。     

液相色谱-串联质谱法与气相色谱-串联质谱法测定茶叶中苦参碱残留量

建立了茶叶中苦参碱残留检测的两种前处理方法,比较了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)与气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)检测茶叶中苦参碱残留量分析方法的适用性。结果表明,在添加标准样品10~100μg/kg 3个水平时,两种前处理方法的回收率和精密度无显著差别;GC-MS/MS和LC-MS/MS回收率分别为81%~85%、82%~86%,相对标准偏差(RSD)分别为4.6%~11.5%和2.9%~4.2%。结果表明两种样品前处理方法以及LC-MS/MS与GC-MS/MS检测均能满足茶叶中苦参碱残留量的测定,但采用前处理方法二,LC-MS/MS检测茶叶中苦参碱残留更具优势。     

基质固相分散-液相色谱串联质谱法同时检测鸡蛋中15种真菌毒素生物标志物

采用基质固相分散( Matrix solid phase dispersion, MSPD)技术,结合高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱联用技术( HPLC-ESI-MS/MS)分析,在多反应监测( MRM)模式下建立了鸡蛋中呕吐毒素、黄曲霉素、玉米赤霉烯酮等15种真菌毒素生物标志物的同时定量分析的方法。样品与吸附剂C18颗粒直接混合装柱,并用20 mL 1 mmol/L甲酸铵的乙腈/甲醇(1：1, V/V)溶液洗脱、吹干,萃取液经复溶、过滤后即可进行检测,整个分析过程无需复杂的净化、离心等步骤。本方法在0.2~100 ng/mL范围内具有良好的线性关系,相关系数R2逸0.9931,检出限在0.05~2.0μg/kg 之间,定量限在0.2~4.0μg/kg 之间,样品的提取回收率为61%~90%。     

液相色谱-串联质谱法测定人血浆中卡托普利的浓度

建立了测定人血浆中卡托普利的LC/MS/MS法。取血浆0.2 mL,用对溴苯甲酰甲基溴进行衍生化,经甲醇沉淀蛋白后,以甲醇-10 mmol/L乙酸铵-甲酸(80/20/0.4,V/V)为流动相,用Zorbax SB-C18柱分离,通过配有电喷雾离子化源的四极杆-线性离子阱质谱仪,以多反应监测(MRM)方式进行检测。用于定量分析的离子反应分别为m/z416→m/z216(卡托普利衍生物)和m/z28→m/z193(安定)。卡托普利的线性范围为2.5~1000μg/L,最低定量限为2.5μg/L,样品分析时间为2.0 m in。该法精密、准确,在灵敏度和分析速度上优于以往文献报道,适用于游离型卡托普利血药浓度的监测和药动学研究。     

液相色谱串联质谱法定量检测青花菜中L-硒甲基硒代半胱氨酸

建立了液相色谱串联质谱(LC-MS-MS)法测定青花菜中L-硒甲基硒代半胱氨酸(SeMC)含量的方法。植物样品经沸水提取,以甲醇-0.1%七氟丁酸水溶液(30∶70)为流动相,滤液经Waters Symmetry C18(50 mm×3.9 mm,5μm)分离,经在线电喷雾离子源(ESI)正离子化后,采用多反应离子监测方式(MRM)选择m/z184.0→(167.0,94.9)测定SeMC。SeMC的线性范围为0-200 mg/L,准确度在96%-114%之间,日内日间精密度(RSD)在±10%内。检出限为0.1 mg/kg。结果表明:本方法高效、准确,特异性强,样品处理简单,可准确定量富硒青花菜中的SeMC。     

液相色谱-串联质谱法测定动物肝脏中黄曲霉毒素

建立了动物肝脏中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品经体积比为84∶16的乙腈-水溶液提取,离心后通过真菌毒素多功能净化柱,净化液氮气吹干,用流动相定容,采用C18柱分离,10mmol/L的甲酸铵溶液和甲醇作为流动相,以50∶50比例等度洗脱,在多重反应监测(MRM)正离子模式下进行分析。各组分在9min内完全分离,方法线性关系良好,黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的检出限分别为0.030、0.026、0.016、0.027μg/kg,三个加标水平下平均回收率在81%～98%之间,相对标准偏差小于2%。该方法简便快速,准确可靠,可用于动物肝脏中黄曲霉毒素的测定。     

同位素编码衍生-高效液相色谱串联质谱法测定果蔬样品中的羧酸类植物生长调节剂

以d0/d3-10-甲基吖啶酮-2-磺酰哌嗪( d0/d3-MASPz)为同位素编码衍生试剂,建立了高效液相色谱串联质谱( HPLC-MS/MS)快速测定果蔬中6种羧酸类植物生长调节剂的分析方法。分别以d0-MASPz(轻型)和d3-MASPz(重型)为衍生样品和对照品,混合后进行HPLC-MS/MS分析。轻型和重型衍生物分别以[ M+H]+m/z 208.2和[M+H]+ m/z 211.2作为多级反应监测离子对,以重型衍生物作为相应轻型衍生物的内标物,建立定量分析方法。结果表明,在6.5 min内可实现6种分析物的完全分离,轻/重衍生物保留时间差异小于0.026 min,6种分析物的轻/重信号强度比在10倍动态范围内线性关系良好,相关系数r>0.9991,检测限和定量限分别为0.19~0.34μmol/L和0.53~0.96μmol/L,相对标准偏差小于3.8%,标准加入的回收率为95.3%~105.5%之间。     

液相色谱-串联质谱法测定苹果中水胺硫磷

建立苹果中水胺硫磷残留的液相色谱-串联质谱检测方法。样品以乙腈提取,采用电喷雾正离子源(ESI~+)和多重反应监测(MRM)模式测定,基质匹配标准曲线定量。结果表明:苹果基质中,水胺硫磷色谱峰面积响应值与其质量浓度呈良好线性关系(r~2=0.999),方法的线性范围为0.3~100μg/L,检出限为0.15μg/L,定量限为0.5μg/L。在5,50,100μg/kg添加水平下,水胺硫磷回收率为77.3%~95.2%,测定结果的相对标准偏差为5.7%~8.9%(n=6)。方法精密度和准确度满足残留限量监测要求。     

气相色谱-串联质谱法测定沉积物中有机磷酸酯

比较了不同提取方法、净化方法对沉积物样品中有机磷酸酯(Organophosphate esters,OPEs)的富集、净化效果,建立了气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)检测沉积物中8种OPEs的分析方法.用20 mL正己烷-丙酮混合液(1∶1,V/V)、涡流振荡+超声提取两次,Florisil固相萃取柱净化、8 mL乙酸乙酯洗脱,浓缩后将溶剂置换成正己烷,采用DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)进行分离,质谱检测器在选择反应监测模式(SRM)下进行分析,内标法定量.结果表明,此前处理方法操作简单、溶剂耗量少;在3个添加浓度水平下,OPEs(除TEP外)的回收率在80％～ 120％之间,检出限为0.31 ～ 65 ng/L,且有良好的精密度与准确度.     

超声萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定大气颗粒物中甾醇类化合物

采用超声萃取与液相色谱-串联质谱联用,建立了快速测定大气颗粒物中甾醇类化合物的方法.甾醇类化合物用甲醇超声萃取,浓缩后使用液相色谱-串联质谱分析.采用Waters公司Atlantis C18色谱柱(100mm× 2.1 mm,3μm),以乙腈和水混合流动相梯度洗脱,实现了胆甾醇、豆甾醇、菜油甾醇及β-谷甾醇的分离.并在APCI-MS/MS MRM模式下定量检测.在选取的实验条件下,方法回收率在80.3％～97.7％之间,检出限0.015 ng/m3,相对标准偏差小于15％,日内及日间测定精密度小于20％.本方法具有较好的准确性及精密度,实际样品的测试结果表明,方法可以满足大气颗粒物中甾醇类化合物的定量分析要求.