犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因的合成和杆状病毒表达载体的构建

目的串联合成犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因,并构建其杆状病毒表达载体。方法利用生物信息学软件,预测N蛋白的抗原表位,串联合成这些抗原表位。利用定向克隆的方法,将该基因片段连接到杆状病毒表达载体pFastBac-Hta。结果获得了包含犬瘟热病毒N蛋白抗原表位的基因,并成功构建pFastBac-N合成表达载体。结论该实验为犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因在杆状病毒内的表达奠定了基础。     

新城疫病毒HN蛋白表达条件的优化、纯化及其活性鉴定

为提高HN蛋白在毕赤酵母中的表达水平,本研究从不同诱导时间、培养基不同pH、不同甲醇诱导剂量等因素对HN基因在毕赤酵母中的表达条件进行优化。按最适条件大量诱导表达,对表达产物进行纯化,并通过血凝试验检测其生物学活性。结果表明pPICZαA-HN／X-33在培养液pH6．0,2．0％甲醇浓度、诱导96h时为最优条件,HN蛋白的表达量最高,可达0．3mg／mL,并具有较好的生物学活性。     

neuritin基因杆状病毒表达载体的构建

为研究Neuritin蛋白的功能,将neuritinORF在杆状病毒-昆虫表达系统中表达,构建杆状病毒表达载体.以308D10为模板,利用PCR方法扩增neuritinORF,定向克隆法将其克隆至PFASTBAC-HTA转移载体中.然后利用同源重组原理将其转移至杆粒bacmid中.得到携带neuritin ORF的重组杆粒.本实验获得了重组目的基因真核表达载体并经PCR鉴定,插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符,成功构建了Neuritin的杆状病毒表达载体.     

表达血型糖蛋白A和带3蛋白膜段基因的杆状病毒转移载体的构建

用RT-PCR方法从K562细胞中扩增了410bp的血型糖蛋白A基因,以含有带3蛋白全长基因的质粒为模板扩增了1.5kb的带3蛋白膜段基因,分别克隆到pMD18-T载体上,筛选到阳性重组子pMD18-T-GPA和pMD18-T-B3m.再将基因分别亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中,随机筛选得到重组病毒转移载体pBacGPA和pBacB3m,为表达和进一步研究血型糖蛋白A和带3蛋白的相互关系打下基础.     

重组杆状病毒的研究——Ⅱ.带标记的多角体转移载体质粒的构建

用大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因,杆状病毒ETL启动子和含多角体基因的病毒DNA片段构建了多角体转移载体质粒pEZGL,还对其特点进行了讨论。     

猕猴B病毒妒和gC合成基因重组杆状病毒质粒的构建

目的构建猕猴B病毒gB和gc合成基因的杆状病毒重组质粒（rBacmid）。方法根据本室已经合成的猕猴B病毒gB基因和gc基因,利用BamHI和XhoI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒的pFastBacHTA转座载体。将该阳性转座载体转化到DHlobac感受态细胞,从中筛选出阳性重组细菌,并提取重组质粒。结果获得了重组质粒bacmid—gB和bacmid—gC。结论该研究为猕猴B病毒gB和gc蛋白在杆状病毒系统内的表达奠定了基础。     

表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建

采用BAC－TO－BAC杆状病毒表达载体体系构建了表达鸡传染性支管炎病毒（IBV）呼吸型毒株SD／97／01S1蛋白的重组杆病病毒，含SD／97／01株S1基因原重组质粒p MDSD9701S1用BamHI和SalI双酶切后，回收的片段并克琶杆病病毒转座载体pFASTBACHTa中多角体基因启动子的下游，筛选出重组转座质粒pFASTSD9701S1U并转化大肠杆菌DH10BAC后,获得重组穿梭质粒rBacmidSD9701S1，用重组穿俊质粒DNA转染昆虫Sf9细胞，获得了含SD／97／01S1基因的重组杆状病毒rAcSD9701S1，重组病毒感染Sf9细胞后，用SDS－PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析。结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD／97／01的S1蛋白，该蛋白具有天然蛋白的抗原性。     

重组杆状病毒的研究 Ⅰ.含大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的粉纹夜蛾核型多角体病毒

以昆虫杆状病毒(Baculovirus)为载体、昆虫虫体和昆虫细胞为受体的基因工程,是目前正在开拓的富有前途的新领域之一.杆状病毒载体系统的优点在于:对外源基因的容量大;病毒基因组能提供一个可插入外源基因而对病毒复制本身不受影响的非必需区(多角体基因),同时提供一个极强的启动子,使植入的外源基因能高效表达;能大规模低成本地饲养寄主昆虫,从而有可能大量获得具有重要经济价值的外源基因表达产     

含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

针对FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重点,而病毒样颗粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似传统灭活疫苗的良好免疫效果,近年来逐渐成为疫苗研究的一个新方向.本实验利用猪圆环病毒PCV2的衣壳蛋白(CAP)作为载体,分别插入FMDV MYA98毒株的抗原表位组合——VP1蛋白上B细胞表位141~160aa(B)与串联的B细胞和T细胞表位141~160aa-21~40aa-141~160aa(BTB),构建对应重组杆状病毒,分别命名为reBAC-CAP-B,reBAC-CAP-BTB.将上述病毒颗粒转入Sf9细胞表达,收获重组杆状病毒并再次感染Sf9细胞扩大病毒滴度,获得目的蛋白CAP-B,CAP-BTB,经过SDS-PAGE,Western blot鉴定正确,透射电镜观察到20~30nm大小的目的颗粒.     

GFP标记的GDNF重组腺病毒载体的构建和体内外表达

通过构建绿色荧光蛋白(GFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)共表达的腺病毒载体,讨论其在治疗脊髓和脑有关神经系统疾病的潜在应用价值,了解腺病毒载体在大鼠体内的分布及在体外分泌外源基因产物能力,并对其生物安全性作了初步考察,为GDNF重组腺病毒载体在临床和基础研究中的应用作了一定准备．     

新城疫病毒TL1株P、NP、L蛋白基因表达载体的构建及鉴定

将新城疫病毒TL1株的P、NP、L基因通过RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pGEM-Teasy载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,命名为pCI-P、pCI-NP、pCI-L,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确.纯化后的重组质粒单独转染BHK-21细胞,经间接免疫荧光试验检测到了P、NP、L蛋白的表达.新城疫病毒TL1株的P、NP、L基因的克隆成功,为即将进行的新城疫病毒的反向遗传操作奠定了基础.     

鸡染色质绝缘子HS4的不同区域对杆状病毒表达egfp基因的影响

染色质绝缘子是一种具有保护目的基因免受周围基因调控影响,保证基因稳定表达的DNA元件.前期的研究表明,当鸡染色质绝缘子HS4被置于目的基因表达框下游时,可以显著提高杆状病毒介导的基因的表达水平.为了进一步认识HS4作用的机制,构建了携带HS4绝缘子不同区域的6种重组病毒,比较了它们对报告基因egfp表达的影响.结果发现,相比对照病毒,插入HS4全长片段的重组病毒vBG-HS4-1200,以及同时插入250bp核心区域和400bp连接片段的重组病毒vBG-HS4-650在感染Sf9细胞后报告基因egfp的表达水平明显提高.这个结果与前人在哺乳细胞表达系统中所得出的结果基本相符,从而进一步证实HS4在裂解型病毒中同样可以通过表观遗传学修饰调控基因的表达.     

Antibodies against analogous heptad repeat peptide HR212 of Newcastle Disease Virus inhibit virus-cell membrane fusion

Membrane fusion is a key step in enveloped virus entry. Highly conserved heptad repeat regions (HR1 and HR2) of Newcastle disease virus (NDV) fusion protein (F) are critical functional domains for viral membrane fusion. They display different conformations in the membrane fusion states and are viewed as candidate targets for neutralizing antibody responses. We previously reported that an analog of heptad repeat peptides HR2-HR1-HR2(HR212) and HR2 could inhibit NDV induced cell-cell membrane fusion. Here, we show that HR212 can induce the production of highly potent antibody in immunized rabbits, which could recognize full length peptides of both HR1 and HR2, and inhibit NDV hemagglutination and NDV entry. These suggest that either HR212 or its antibody could be an inhibitor of virus-induced cell-cell membrane fusion.     

人甲胎蛋白增强子和鸡HS-4绝缘子对杆状病毒基因表达的影响

构建了2株重组杆状病毒AcGFP-E和AcGFP-E-I.两者均带有绿色荧光蛋白报告基因(gfp)的表达框和人甲胎蛋白增强子,同时后者还在报告基因表达框两侧带有鸡HS-4绝缘子.在昆虫细胞Sf9中,两种重组病毒都能正常复制.与仅带有报告基因的对照重组病毒AcGFP比较,AcGFP-E表达GFP的水平明显提高,但AcGFP-E-I表达水平却明显降低.这项研究首次分析了异源增强子和绝缘子对杆状病毒基因表达的影响,但其中的机制还有待深入研究.     

斜纹夜蛾杆状病毒流行病模拟模型研究

根据斜纹夜蛾生物生态学及其杆状病毒病流行的一般规律，建立了斜纹夜蛾杆状病毒流行病的微分方程模拟模型，模拟系统由１８个微分方程组成，可以模拟易感的和染病的１～６龄幼虫、蛹、成虫，卵的种群动态．模拟模型包含４个分室，即易感种群过程，染病种群过程，病毒在作物上的积累过程，易感种群和染病种群的相互转化过程．系统中纳入了作物生长对病毒数量的稀释效应，以及病毒数量的自然衰减作用．模型参数须由试验测定得到．给出了杆状病毒病的有关试验参数     

Antibodies against analogous heptad repeat peptide HR212 of Newcastle Disease Virus inhibit virus-cell membrane fusion

Membrane fusion is a key step in enveloped virus entry. Highly conserved heptad repeat regions (HR1 and HR2) of Newcastle disease virus (NDV) fusion protein (F) are critical functional domains for viral membrane fusion. They display different conformations in the membrane fusion states and are viewed as candidate targets for neutralizing antibody responses. We previously reported that an analog of heptad repeat peptides HR2-HR1-HR2(HR212) and HR2 could inhibit NDV induced cell-cell membrane fusion. Here, we show that HR212 can induce the production of highly potent antibody in immunized rabbits, which could recognize full length peptides of both HR1 and HR2, and inhibit NDV hemagglutination and NDV entry. These suggest that either HR212 or its antibody could be an inhibitor of virus-induced cell-cell membrane fusion.     

猪口蹄疫病毒基因工程疫苗的工程菌的发酵研究

在猪口蹄疫病毒活性肽ＶＰ１融合蛋白基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＣ５００构建成功的基础上，研究了Ｃ５００的质粒稳定性，Ｃ５００在４种不同培养基中的生长曲线，以及不同种龄，接种量，装液量，碳源氮源对菌体生长的影响。     

Complete Nucleotide Sequence of a Newly Avirulent Newcastle Disease Virus Hubei 92(HB92) Strain

Newcastledisease (ND )isaseriousaviandiseasewithworldwidedistributionthatcancausesevereeconomicloss esinthepoultryindustry .Thecausativeagentofthedisease ,newcastlediseasevirus(NDV)alsoknownasavianParamyxovirustype 1,isamemberoftheParamyxoviridaeandcontainsasin gle strandednegativesenseRNAgenomeencompassing 15 186nucleotides[1 3] .Theviralgenomecontainssixgenes ,whichen codetheviralnucleoprotein(NP) ,phosphoprotein(P) ,matrixprotein(M ) ,fusionprotein (F) ,hemagglutinin neuraminidase(HN…