转录因子Skn-1a激活人乳头瘤病毒18 E6基因表达的分析

用脂质体介导真核表达质粒pcDNA3-skn-1a转染Hela细胞,实时定量PCR检测HPV18 E6基因的表达量,以探讨转录因子Skn-1a对HPV18 E6基因表达的调控.结果显示Skn-1a能够显著激活HPV18 E6基因表达,为高发宫颈癌E6基因调控的分子机理探讨提供理论依据.     

北美海蓬子甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达载体构建

以北美海蓬子种子为材料, 采用RACE技术获得北美海蓬子BADH基因的cDNA全长序列. 结果表明: BADH基因cDNA全长为1836bp, 其中开放阅读框(ORF)为1503bp, 编码500个氨基酸, 预测蛋白的分子量为54.5kDa, 理论等电点为5.31. 推测出BADH氨基酸中含有甜菜碱醛脱氢酶家族高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)及与酶功能相关的半胱氨酸残基(Cys). 序列比对和系统进化树显示, 北美海蓬子与盐节木和盐穗木的亲缘关系最近, 同源性达94%. 并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-BADH, 将其成功导入到农杆菌EHA105中, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

凡纳滨对虾亲环素A基因的克隆及表达分析

通过电子克隆所得基因序列设计引物,采用RT-PCR方法首次克隆得到长度为885 bp的凡纳滨对虾亲环素A（Cyclophilins A）CYPA基因cDNA序列,其开放阅读框为35~529 bp,可编码164个氨基酸.推算其分子量约为17.6×103,理论等电点为8.55.与其他物种的CYPA基因比对发现,该基因的氨基酸序列具有较高的保守性.基于氨基酸序列的聚类分析表明,凡纳滨对虾与斑节对虾的亲缘关系最近.荧光定量PCR的结果显示该基因在组织中广谱表达,在抗病组中,胃中的表达量最高,心脏中的表达量最低,差异约为2倍.而在感病组中,该基因在心脏中的表达量最高,肌肉中的表达量最低.利用ProtFun在线预测蛋白质的功能分类,表明CYPA基因可能是一免疫应答抑制因子,参与凡纳滨对虾免疫防御反应.     

bop基因及其上游启动子的克隆与表达

应用重组PCR的方法，直接从盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)S9的基因组DNA上扩增到了编码细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)的基因——bop基因及其启动子部分(1196bp)，并将其克隆到表达载体pXLNovR后，在宿主菌株中得到了表达．测序结果表明，扩增得到的片段与NCBI数据库中的bop基因及启动子的序列完全相同，且其表达产物的分子量与野生型BR蛋白的分子量一致，并且在568nm处表现出BR蛋白特征吸收峰．本方法与其他方法(如逆转录PCR，建立基因文库后从中调取等方法)相比具有操作简便，成功率高的优点．     

人nov基因全长cDNA克隆、测序及其组织表达谱分析

采用特异性mRNA富集技术，从人早期胚胎中得到人nov基因(novH)的cDNA克隆，序列分析表明，该基因cDNA序列由2389个碱基对组成，包含一段长1071bp的开放阅读框(ORF)，3′端含有加尾信号AATAAA和ply(A)尾巴。Northern杂交显示，在Hela细胞和肾上腺组织中有表达的novHmRNA，大小约为2．5kb；多组织RNA点杂交分析结果进一步表明，novH基因在肾上腺和主动脉中的表达水平相对较高，在成人肾、肝、肺和小肠组织中亦有少量的表达。     

半滑舌鳎DMRT 1基因的克隆与表达分析

利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的DMRT 1基因;并用RT-PCR技术检测了该基因在半滑舌鳎不同发育时期以及雌雄成鱼的不同组织的表达情况.结果表明,该基因cDNA序列全长1 232 bp(GenBank登录号为EU007655),包括774 bp开放阅读框,131 bp5′非翻译区以及含poly(A)信号的329 bp的3′非翻译区,编码258个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎DMRT1氨基酸序列与牙银汉鱼、黑鲷、青鳉、河豚和斑马鱼DMRT1氨基酸序列的同源性分别达到了63%、59%、54%、53%和52%;与光滑爪蟾、小鼠和人类的同源性较低分别为38%、42%和41%.RT-PCR分析表明,DMRT 1基因在半滑舌鳎早期胚胎不同发育时期和孵化后5、13、18、22和35 d的仔鱼均有表达,在孵化后22 d表达量最高.在成体鱼中只在雄性精巢中有特异表达,其他组织均无表达,表明该基因可能参与半滑舌鳎雄性性腺的发育或精子的形成.     

猪胃蛋白酶原A基因cDNA的克隆及其表达

根据GenBank中发表的猪胃蛋白酶原A（pepsinogen）基因序列设计引物，采用RTPCR技术，成功获得了猪胃蛋白酶原A基因，该基因全长1240bp，将该基因克隆到表达载体pPIC3．5K的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点构建重组表达质粒，通过电转化方法将重组质粒转化毕赤酵母GS115，检测结果表明猪胃蛋白酶原A基因在毕赤酵母中得到了表达．     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌—杆状病毒穿梭系统（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）将一套含有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐＳ６５Ｔ）和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地形成多角体,并在紫外光照射下产生强烈的绿色荧光,以重组病毒感染粉纹夜蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）幼虫后,在阳光下即可看到发射绿色荧光的幼虫,在手提式长波紫外光照射下绿色荧光更为强烈,带绿色荧光的幼虫在昆虫生态学和杆状病毒流行病学等研究领域有广泛的用途     

集胞藻PCC6803脂肪酸脱饱和酶基因desD在转基因水稻中的表达

为了提高水稻的耐冷性，从集胞藻PCC6803中克隆酰基脂肪酸脱饱和酶基因desD与植物表达载体pCAMBIA1301连接，构建了重组质粒pCdesD。采用农杆菌介导的水稻愈伤组织转化系统将desD基因成功地导入粳稻中花11号和朝鲜的平壤21号中，获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析，证明外源基因已导入并整合到水稻的基因组中；分子检测外源基因单拷贝整合的转化体在T1代呈现3：1的分离。Northern杂交结果表明该基因在mRNA水平上获得表达。低温胁迫处理后，对转基因水稻进行脂肪酸成分和光合生理分析，结果表明转基因水稻提高了不饱和脂肪酸含量，光合生理也得到了改善，水稻的耐寒能力明显增强。     

D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的诱导表达

利用乳糖代替IPTG作为诱导剂,对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pWY中的D-氨基酸氧化酶进行诱导表达。分别研究了乳糖浓度、菌体浓度、诱导温度、诱导时间对DAAO酶活的影响。结果显示,当菌浓OD600达1.0左右、乳糖浓度为10 g/L、28℃下诱导约6 h,摇瓶发酵得到的DAAO酶活高达2 400 IU/L,