多肽的快原子轰击和质量分离离子动能谱法分析

本文报道了用快原子轰击与质量分离离子动能谱(FAB-MIKES)技术测定三个多肽(七肽、八肽和九肽)中氨基酸的顺序。通过解释谱图上的肽段质子化的离子峰和碎片峰,证明用本项技术测得的氨基酸顺序与已知的完全一致。     

天花粉蛋白一级结构的修正及不同产地天花粉蛋白的研究

胰蛋白酶酶解天花粉蛋白, 用高效液相色谱分离酶解肽段, 用顺序仪测定其有关肽段的顺序。用羧肽酶A, B, Y测定了天花粉蛋白C-端和天花粉蛋白溴化氰降解肽CB1的C-端顺序, 修正了我们1985年测定的天花粉蛋白一级结构, 证明天花粉蛋白由246(7)氨基酸残基所组成, 除C-端微观不均一外, 与Collins结果一致。同时比较了芜湖产天花粉蛋白一级结构与平湖产的天花粉蛋白一级结构, 没有发现两者的一级结构有差别。     

栝楼蛋白 2: 栝楼蛋白部分化学结构的初步测定

栝楼蛋白(Trichobitacin)是从栝楼(Trichosanthes kirilowiiMaxim, Cucurbitaceae)中新发现的核糖体失活蛋白, 分子量为27,228; pI为9.6。应用基质辅助的激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和快原子轰击质谱法(FAB-MS)分别测定胰蛋白酶酶解栝楼蛋白和天花粉蛋白(Trichosanthin)的混合肽质谱, 通过比较发现了一些分子量相同的肽。由于这两种蛋白质都来源于栝楼块根, 同源性比较强, 所以这些肽序列在两种蛋白质中基本一样; 再结合蛋白N-端自动顺序仪测定栝楼蛋白N-端的结果, 确定了栝楼蛋白N-端38个氨基酸的顺序, 栝楼蛋白经胰蛋白酶酶解后所得肽段用HPLC分离纯化, 再用蛋白质自动顺序仪, DABITC/PITC双偶合手工法和质谱法共确定了栝楼蛋白N-端, C-端等100多个氨基酸残基的序列。     

栝楼蛋白 2: 栝楼蛋白部分化学结构的初步测定

栝楼蛋白(Trichobitacin)是从栝楼(Trichosanthes kirilowiiMaxim, Cucurbitaceae)中新发现的核糖体失活蛋白, 分子量为27,228; pI为9.6。应用基质辅助的激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和快原子轰击质谱法(FAB-MS)分别测定胰蛋白酶酶解栝楼蛋白和天花粉蛋白(Trichosanthin)的混合肽质谱, 通过比较发现了一些分子量相同的肽。由于这两种蛋白质都来源于栝楼块根, 同源性比较强, 所以这些肽序列在两种蛋白质中基本一样; 再结合蛋白N-端自动顺序仪测定栝楼蛋白N-端的结果, 确定了栝楼蛋白N-端38个氨基酸的顺序, 栝楼蛋白经胰蛋白酶酶解后所得肽段用HPLC分离纯化, 再用蛋白质自动顺序仪, DABITC/PITC双偶合手工法和质谱法共确定了栝楼蛋白N-端, C-端等100多个氨基酸残基的序列。     

反相高效液相色谱分离肽的有关实验问题

最近几年,由于高效液相色谱(HPLC)的应用,氨基酸、肽和蛋白质的分离分析进入了全新阶段。在蛋白质和肽化学研究中,HPLC已成为主要工具之一。对于肽和氨基酸,主要的分离方法是反相HPLC,并采用紫外光或萤光检测。选择什么样的分离条件,即选择什么样的流动相(有机溶剂和缓冲液)、固定相和检测手段,主要从样品的     

蛋白质顺序测定技术(三)

三、蛋白质的化学降解~([1,2,3,4]) 在蛋白质一级结构的测定中,化学降解也是一个很重要的手段。一般化学降解的肽段都比较大,适合于在自动液相顺序仪中测定顺序,同时也有利于肽段次序的排列,但因肽段较大,分离困难,往往碰到不溶解和集聚等问题,产率也比较低。蛋白质化学降解常用的方法有。1.用溴化氰`~([5])(CNBr)降解蛋白质中的甲硫氨酸;2.用二甲基亚砜(DMSO)~([6])和卤氢酸等降解蛋白质中的色氨酸;3.用羟氨降解蛋白质中-Asn-Gly-结构;4.用稀酸~([?])部份降解蛋白质中Asp等。现在分述如下: (一)溴化氰降解用溴化氰降解蛋白质中的甲硫氨酸是化学降解中最常用的方法,特别是反应专一,产率比较高。又由于蛋白质中甲硫氨酸数目较少,因此降解后肽段数目也比较少,有利于肽段次序的排列。其反应机理如下:     

计算机辅助的羧肽酶法测定多肽羧端顺序

在初步用计算机辅助的羧肽酶法测定了天花粉蛋白C-端顺序的基础上, 进一步设计了两个计算机程序-DPS程序和CPA程序. 用合成小肽和天然的肽对这两个计算机程序进行模型实验证明, 运用这两个程序能分别满意地从羧肽酶的酶解动力学曲线中获得重要的C-端顺序信息, 并测定了天花粉蛋白分子中未知肽段CB-3的C-端顺序为: -SerAlaSerAlaLeuHserOH, 这一顺序后来已经其他实验结果所证实. 本法不仅使C-端顺序测定延长至七个氨基酸, 而且还基本上解决了多肽或蛋白质含有多种多次重复氨基酸残基的C-端顺序测定.     

反相高效液相色谱/电喷雾质谱法分析化学合成七肽粗产物

利用RP—HPLC／ESI—MS直接分析用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成方法在PHB树脂上偶联合成的一个七肽(H2N—Tyr—Val—Asn-Thr-Asn—Met—Gly—COOH,Mr797．3)粗产物。RP—HPLC显示合成粗产物含有1个主成分,4个次要成分和多个微量成分;与之联用的电喷雾质谱则同步准确地测定出各成分的分子量(m／z)并自动对各主要成分的化学结构进行了串联质谱分析。结果证明,粗产物中的主成分即为目标七肽,另外几个主要副产物为七肽的氧化产物或残缺肽。     

高效液相色谱在生物医药研究中的应用（Ⅱ）肽化学研究中的高效液相色谱

七十年代中期以来.色谱学家逐步建立起包括反相HPLC的一整套色谱方法,并运用这些方法在肽的分离纯化,制备,定性定量分析,分子量测定,肽结构与其色谱保留值关系等方面进行了深入的研究。八十年代以来,HPLC在肽化学研究领域得到了广泛应用,取得突破性进展。主要表现在,人们利用HPLC并与其它方法相结合,发现了许多新的天然活性肽,特别是神经肽。如作者自83～88年不完全统计,已确定一级结构的新活性     

用N,N-二甲基六烷基溴化铵涂层的毛细管对重组促红细胞生长素及其酶解产物进行毛细管电泳和毛细管电泳-电喷雾质谱分析

采用毛细管电泳技术研究了重组促红细胞生长素(rhEPO)的分离问题。用N,N-二甲基六烷基溴化铵（6,6-ionene）涂层的毛细管测定了rhEPO中唾液酸的微多相性,同时采用毛细管电泳-质谱(CE-MS)联用技术在22 min内鉴定了rhEPO 20段胰酶消化肽中的11段。该方法简单快捷,重现性好,可用于蛋白质一级结构的测定。     

新型等点聚焦系统用于蛋白质组样本的预分离方法研究

对蛋白质或多肽的高效分离,将有利于降低肽段信号之间的干扰,保证规模化的蛋白质组学深度覆盖鉴定,并提高定量蛋白质组分析的准确性。本研究采用一种新型的等电聚焦预分离系统(OFFGEL),考察系统对293T细胞在蛋白质与肽段水平的分级分离效果,在OFFGEL系统中聚焦后的蛋白质或肽段可以从溶液中直接回收,与下游的LC-MS/MS肽段鉴定流程兼容。实验结果表明,肽段的分离效果明显优于蛋白质的分离,分级分离后各馏分对应的等电点位置与肽段的理论等电点分布高度一致,每个馏分中单独鉴定的肽段比例超过90%,显示了该系统对肽段的高分辨分离能力,结合生物质谱技术,在293T细胞中实现6727个蛋白质的规模化鉴定,表明该系统在复杂体系蛋白质组研究中的应用潜力。     

东亚钳蝎昆虫毒素BmK IT的初级结构研究

从中国产东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch)毒中纯化的一个昆虫毒素BmK IT经还原和羧甲基化处理后,分别用TPCK-胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌蛋白酶进行用TLC-薄膜分离酶解的肽段并分别测定了它们的氨基酸顺序。将BmK IT及其酶解肽段的氨基酸顺序的测定结果与由非洲产蝎Androctonus australis Hector毒中纯化的昆虫毒素AaH IT的初级结构进行参照对比,我们发现两种昆虫毒素的分子结构中仅有16个残基部位发生了变异,其同源性高达75％以上。这一结果为探讨蝎昆虫毒素的分子结构特征以及结构与功能的相互关系提供了重要资料,也为这类毒素的开发利用,如作为神经生物科学研究中的工具物或探讨作为生物杀虫剂的可能性等提供了必要的分子基础。     

多肽研究——Ⅰ.α-人心房肽(α-hANP)带保护基的片段的合成

本文报道了与α-人心房肽(α-hANP)的A_1—A_4四肽及A_5—A_(10),A_(11)—A_(16),A_(17)—A_(22),A_(23)—A_(28)四个六肽片段对应的带保护基片段的液相法合成。在有些肽段的合成中,比较了混合酸酐法和活泼酯法所得的结果。在另一些肽段的合成中,观察了反应温度、催化剂的碱性及反应时间对产物产率的影响。上述带保护基的片段均由快原子轰击质谱测定氨基酸顺序,确认结构准确无误。     

反相高效液相色谱法分离制备蜂毒肽类似物

应用高效制备液相色谱法，对5种合成的蜂毒肽类似物分离制备。当用极性较强的洗脱液做流动相时，主峰的保留时间短，且主峰和前后的杂质峰不能很好的分开；随着洗脱液极性减弱至某一值时，主峰和杂质峰的保留时间均向后延长，且时间间隔加大，可以成功地对多肽样品进行分离制备。有多肽分子中各氨基酸保留常数加和值的方法可以预测不同多肽的保留时间，为选择分离纯化多肽所需的流动相提供了参考作用。经半制备分离纯化后的产物用分析型RP－HPLC测定达到了很高的纯度，氨基酸分析结果表明得到了所需的肽段，可以用于下一步的研究工作。     

蛋白质顺序测定的策略

近年来蛋白质顺序测定在自动化、微量化与策略方面都有显著的进展。用DNA顺序分析技术间接地测定蛋白质顺序的策略已被广泛地采用,它能加快但不能代替蛋白质的顺序测定。质谱技术测定蛋白质顺序的途径也有了可喜的突破。高效液相色谱分离肽技术的发展、限制性酶切及各种选择性的化学与酶的降解方法的出现,为蛋白质顺序测定提供了更多可选用的工具。     

氨基酸-稳定同位素稀释质谱法用于合成肽段准确含量分析

建立了氨基酸同位素稀释液相色谱-串联质谱法准确测定合成肽段绝对含量的方法。实验中对合成肽段的纯度进行了表征,色谱纯度表征结果为99%以上,质谱纯度为90%以上。在肽段溶液中加入13C标记的氨基酸后进行酸溶液水解时间的优化,水解后的氨基酸直接经液相色谱分离和质谱检测,结果表明肽段中的被测氨基酸在150 ℃、6 mol/L HCl溶液水解4～6 h就可以达到水解平衡。每个肽段选择两个或两个以上的被测氨基酸,测得随机选择的5种合成肽段的绝对含量为62.07%～88.18%,测定结果的相对标准偏差小于8%,相对误差小于5%,均满足定量要求。除常用的被测氨基酸苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸外,还考察了选择赖氨酸和精氨酸作为被测氨基酸的可行性,实验结果表明增加精氨酸为被测氨基酸是可行的,从而进一步增加了方法的普适性。该方法的建立避免了色谱法定量时氨基酸衍生化处理带来的副反应影响及操作繁琐等问题,提高了肽段含量测定的准确度和精密度,为肽段含量的准确测定提供了一种新的方法。     

基于反相液相色谱-串联质谱的鹿茸模拟胃肠道消化的肽谱及生物活性研究

利用反相液相色谱-串联质谱(Reversed phase liquid chromatography-tandem mass spectrometry,RPLCMS/MS)对鹿茸蛋白经过模拟消化的肽谱进行分析,同时考察了消化产物的体外活性。从鹿茸水提物(Antler aqueous extract,AAE)、鹿茸水提物消化产物(Aqueous extract digest,AED)和鹿茸的粉末消化产物(Powder digest,PD)中分别鉴定到23、417和389条肽段,其中源于胶原蛋白的肽分别有15、146和75条。以血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)、二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)、脯氨酰内切酶(Prolyl endopeptidase,PEP)抑制活性和抗氧化活性为指标考察AAE、AED和PD的体外生物活性,发现其活性强弱关系为AAEAEDPD。结果表明,经过模拟消化后,AED释放出更丰富的胶原蛋白肽,而PD具有更好的生物活性,说明食用鹿茸粉末和鹿茸水提物互为补充,各具优势。     

肽段固相等电聚焦结合液相色谱-质谱联用技术分析鼠肝蛋白质

利用肽段固相胶条等电聚焦技术对大鼠鼠肝组织蛋白质酶解产物进行预分离,反相色谱分离所得预分离组分后,用LTQ-Orbitrap MS进行分析。共鉴定到2039个蛋白质,包括18个乙酰化蛋白,其中4个乙酰化蛋白未被报道过。对这些蛋白进行了生物信息学分析。结果表明,将肽段等电聚焦与LC-MS/MS结合起来,是一种有效的蛋白质组学分析技术,适合于大规模蛋白质鉴定分析。     

单叶新月蕨稀土富集能力与结合多肽结构研究

以单叶新月蕨(Pronephrium simplex,金星蕨科新月蕨属)为研究对象,研究其在自然条件下对稀土元素的超富集能力.其叶片主动富集的稀土含量高达1249.37 μg·g-1,是母土的51.8倍、土壤中生物可利用态的650.7倍,且稀土元素分异现象与母土一致.在100μg·ml-1 Nd3+胁迫下,单叶新月蕨生长状况良好,且体内Nd含量提高,同时结合多肽的表达增加,证明单叶新月蕨具超富集稀土元素的特性;Nd结合多肽经酸处理脱掉Nd后,HPLC/ESI-IT-Ms的结果显示632Da的肽段是Nd在结合多肽中所处的区域.利用细胞分级、HPLC分离纯化、氨 基酸组成分析以及分子量和酶解肽段的MALDI-TOF-MS及ESI-IT-Ms测定富集过程中起着重要作用的稀土结合多肽,结果显示,稀土结合多肽的分子量为(5.07±0.02)KDa,其中含有-E-T-M-E-,-P-N-L-L-G-E-,-F-V-I-Y-E-和-F-V-I-A-的肽段.     

天花粉蛋白中色氨酸肽键的化学降解研究

用BNPS-Skatole试剂,对琥珀酰化天花粉蛋白的胰白酶酶解肽片段TIG2进行了色氨酸肽键的化学降解。分离纯化了降解反应所生成的肽片段,并测定了新产生的N-端肽片段的氨基酸排列顺序。