NMR研究轴向配体取代对细胞色素c结构的影响

用1D和2D NMR方法归属了Im·cyt c配合物血红素环上质子和20多个氨基酸残基质子的共振峰,集中研究和表征了Im·cyt c配合物中血红素基及轴向配体周围的环境,确定了咪唑取代cyt c中Met 80轴向配体所引起容纳血红素和轴向配体的疏水腔构象的变化,配位咪唑相对于卟啉面和His 18咪唑平面的取向。     

细胞色素c突变研究进展

在简述细胞色素c的生物功能和结构特征的基础上,综述了细胞色素c突变研究的进展,重点论述了对血红素辅基(heme)的轴向配体Met80、heme所在腔的保守氨基酸残基Tyr67以及蛋白表面的保守氨基酸残基Phe82的突变研究,并对一些突变体蛋白表现出来的特殊性质给予解释。     

咪唑-细胞色素c复合物的溶液结构研究

轴向配体在决定血红素蛋白结构和性能方面的作用引起人们的兴趣[1]. 细胞色素c是一个重要的电子传递蛋白, 在天然状态下轴向配体His 18和Met 80与血红素的Fe原子配位. UV光谱和NMR谱显示氧化态细胞色素c配位的Met 80在pH大于9或强外源配体存在时较易被取代[2]. 人们对外源配体配位引发细胞色素c的构象的研究得到一些重要的结构特征[3,4]. 但对整个蛋白溶液结构完整精确的描述和血红素电子结构的研究还很少. 此外, 细胞色素c在重折叠过程中形成组氨酸配位的中间体, 而咪唑能捕获和阻断中间体的形成. 为此, 本文对咪唑-细胞色素c复合物溶液结构进行了研究.     

新型簇合物离子K+(KNO3)n和NO-3(KNO3)m

轴向配体在决定血红素蛋白结构和性能方面的作用引起人们的兴趣[1] .细胞色素 c是一个重要的电子传递蛋白 ,在天然状态下轴向配体 His 1 8和 Met80与血红素的 Fe原子配位 . UV光谱和 NMR谱显示氧化态细胞色素 c配位的 Met80在 p H大于 9或强外源配体存在时较易被取代[2 ] .人们对外源配体配位引发细胞色素 c的构象的研究得到一些重要的结构特征 [3,4 ] .但对整个蛋白溶液结构完整精确的描述和血红素电子结构的研究还很少 .此外 ,细胞色素 c在重折叠过程中形成组氨酸配位的中间体 ,而咪唑能捕获和阻断中间体的形成 .为此 ,本文对咪唑 -…     

咪唑键合细胞色素C的核磁共振共振研究

我们用^1HNMR双共振技术测定了在pH=7.04,温度303-319K范围内咪唑键合氧化型细胞色素C的平衡常数,从Van'tHoff和Arrhenius方程得到键合的热力学常数△H=48.5kj·mol^-1,△S°=184J·mol^-1·K^-1和活化能E~a=159kj·mol^-1,并与其它血红素蛋白和模型化合物的热力学常数作了比较和讨论.用饱和转移法归属了cytc·Im的血红素环上甲基峰,首次用NMR方法确证咪唑在与氧化型cytc反应中取代了轴向Met80,形成新的Fe-N键.     

咪唑键合细胞色素C的核磁共振共振研究

我们用^1HNMR双共振技术测定了在pH=7.04,温度303-319K范围内咪唑键合氧化型细胞色素C的平衡常数,从Van'tHoff和Arrhenius方程得到键合的热力学常数△H=48.5kj·mol^-1,△S°=184J·mol^-1·K^-1和活化能E~a=159kj·mol^-1,并与其它血红素蛋白和模型化合物的热力学常数作了比较和讨论.用饱和转移法归属了cytc·Im的血红素环上甲基峰,首次用NMR方法确证咪唑在与氧化型cytc反应中取代了轴向Met80,形成新的Fe-N键.     

细胞色素c突变体的共振拉曼光谱研究

采用共振拉曼光谱技术研究了细胞色素c一次突变体（WT）及其突变体Y67F和N52I在低频区的光谱特征。结果表明，以苯丙氨酸替代WT中酪氨酸残基Tyr67并没有明显影响血红素丙氨酸侧基周围多肽氨基酸残基的构象，而异亮氨酸对天冬酰胺残基Asn52的取代则较大程度地改变了蛋白质内部水分子与周围氨基酸残基间的氢键作用和多肽空腔的疏水性，进而使氨基酸残基和血素的构象相应发生调变。两种取代都导致形成血红素周围空腔的多肽氨基酸残基构象的变化。     

细胞色素b5突变体V45H NMR初步研究

通过分析在H2O和D2O中采集,DQF-COSY,TOCSY和NOESY等二维核磁共振波谱鉴定了细胞色素b5定点突变体V45H(残基Val^45突变为His^45)的大多数氨基酸残基的质子自旋系统,通过解析NOESY谱中的dNN(i,i+1),dαN(i,i+1),dαN(i,i+2),dαN(i,i+3),dαβ(i,i+3)和dβN(i,i+1)等NOE相关,完成了其序列特异性归属以及主链和侧链质子共振信号的全归属。突变体V45H的二级结构分析表明残基Val^45突变为His^45对分子的整体折叠影响不大。但是,与野生型细胞色素b5相比较,突变体V45H主链酰胺质子的化学位移指数提示突变使其血红素疏水腔的微环境受到扰动。以上实验结果为进一步测定V45H的溶液结构和分析残基Val^45在蛋白质中的作用提供了基础。     

大分子拥挤条件下光诱导细胞色素C还原的光谱研究

稀溶液中高铁细胞色素C（ferric cytochrome c,Fe（Ⅲ）-Cyt c）能被光照还原成亚铁细胞色素C（ferrous cytochrome c,Fe（Ⅱ）-Cyt c）,但这一研究忽略了生物体细胞的真实环境是高度拥挤的,因此采用紫外可见、同步荧光及圆二色谱光谱法研究了大分子拥挤环境中光诱导Cyt c的还原过程及其对外界环境的依赖情况. UV-Vis光谱和同步荧光光谱结果表明,拥挤试剂葡聚糖70（Dextran70）和聚蔗糖70（Ficoll70）的加入利于Cyt c光还原的进行,且Ficoll70存在时Cyt c光还原程度远高于Dextran70存在时;Dextran70和Ficoll70环境中光诱导Cyt c还原的最适温度分别为37 ℃和25 ℃,定波长280 nm光照射利于Cyt c还原;Cyt c的光还原程度随着Dextran70浓度增加而增大,Ficoll70环境中Cyt c的最适光还原浓度为100 g·L^-1;拥挤环境下Met,Trp,Tyr和Phe的存在对光诱导Cyt c的还原过程依Phe> Tyr> Trp> Met顺序有催化促进作用;CD光谱结果表明光照射稀溶液中Cyt c蛋白还原后,其α-螺旋含量降低,β-折叠含量升高,而光照射拥挤环境中Cyt c还原后蛋白的二级结构基本没变化. 结果表明拥挤试剂具有稳定蛋白质二级结构的作用,且影响光还原Cyt c的电子传递过程及效率.     

纳米金三明治结构调制细胞色素c电子传递特性的分子机理研究

以细胞色素c(Cyt c)为模型蛋白,采用表面增强红外吸收光谱监测了三明治结构所吸附的纳米金对氧化还原诱导的Cyt c表面增强红外差谱的改变.研究表明,在单层Cyt c分子表面组装纳米金,使得血红素的红外差谱特征峰明显增强,这归因于纳米金和血红素之间的电子传递.纳米金与Cyt c氧化还原活性中心血红素的相互作用加速了蛋白质的电子传递.这为实现并优化表面吸附蛋白质的直接电化学提供了一种新技术.     

细胞色素b5-蛋白质相互作用研究

蛋白质-蛋白质相互作用在生命过程中发挥至关重要的作用,特别是血红素类蛋白。细胞色素b5(Cyt b5)是血红素蛋白的一个典型代表,在生物体内通过多种蛋白质-蛋白质相互作用来执行其生物功能。目前所揭示的与Cyt b5相关的蛋白质相互作用包括:细胞色素b5-细胞色素b5还原酶,细胞色素b5-细胞色素P450,细胞色素b5-细胞色素c,细胞色素b5-肌红蛋白或血红蛋白,细胞色素b5-融合蛋白(谷胱甘肽S-转移酶GST和绿色荧光蛋白GFP)和细胞色素b5-转运蛋白(蔗糖转运蛋白SUT1和山梨醇转运蛋白SOT6)等。同一蛋白能与众多不同蛋白相互作用的事实,使我们认识到某些特定蛋白的生物学重要性。另一方面,研究同一蛋白与不同蛋白质间的相互作用将会进一步加深我们对蛋白质结构与功能关系的理解,以及指导新颖蛋白的理性设计与最终应用。     

用同步荧光光谱法定量测定细胞色素C

采用同步荧光光谱技术研究了细胞色素C(Cyt C)的同步荧光光谱特性,发现在波长差Δλ=20nm时表现为酪氨酸(Tyr)残基的荧光峰,在Δλ=80nm时为色氨酸(Try)残基的荧光峰。同时考察了浓度对Cyt C同步荧光光谱的影响,为Cyt C的定量测定打下基础。     

血红素蛋白二聚、寡聚与多聚

血红素蛋白在生物体系中执行多种重要的生物功能,如氧贮存和运输、电子传递、生物催化和生物传感等。尽管大多数血红素蛋白是以单体形式存在,一些血红素蛋白在体外和/或体内,还会形成同源聚合物。本文综述了血红素蛋白的二聚、寡聚与多聚研究进展,包括肌红蛋白、细胞色素c、胞红蛋白,细胞色素b₅、细胞色素b₅₆₂、亚硝酸盐还原酶、血红素传感蛋白和血红素转运蛋白等,着重介绍其结构与功能以及多聚体分子设计的方法与应用。这些研究进展,一方面增强了我们对生物体系中血红素蛋白结构与功能关系的认识,另一方面也赋予了我们通过多聚方法设计功能蛋白来调控和利用血红素蛋白的能力。     

表面活性剂对细胞色素C的作用及光诱导还原的影响

通过UV-Vis吸收光谱、普通荧光和同步荧光光谱、圆二色(CD)光谱等技术研究了表面活性剂(阴离子表面活性剂-琥珀酸二辛酯磺酸钠AOT、阳离子表面活性剂-十六烷基三甲基溴化铵、两性离子表面活性剂-3[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸CHAPS)对细胞色素C(Cytochrome c,Cyt c)的相互作用及光诱导Cyt c还原的影响。结果显示:表面活性剂能够与Cyt c相互作用,进而影响Cyt c蛋白的结构及功能的表达。阴离子型表面活性剂AOT与Cyt c发生直接相互作用;阳离子型表面活性剂DTAB与Cyt c不发生作用或作用很小;两性离子型表面活性剂CHAPS是通过静电作用与Cyt c发生相互作用,作用强度很弱,远远低于AOT与Cyt c之间的相互作用。表面活性剂的加入改变Cyt c中Tyr和Trp残基微环境。AOT浓度达到1.25×10~(-3)mol·L~(-1)时Cyt c变性。并且研究结果表明,表面活性剂的存在抑制光诱导细胞色素C的还原,且抑制能力DTABCHAPSAOT。     

细胞色素b5突变体(E44A/E48A/E56A/D60A)的溶液结构研究

电子传递反应是光合作用和生物氧化等一系列重要生物过程的基本反应[1],为阐明细胞色素b5和c的静电结合模型,1993年Northrup等[3]用Brownian动态模拟预言的这两个蛋白结合模型有两种几何形态,根据以下模型设计了许多实验,但对两种模型都至关重要的细胞色素b5血红素暴霞棱周围的4个残基E44,48,56T D60对蛋白质复合物的稳定性以及在蛋白质识别中的作用仍然不清楚,为了阐明这4个带负电的残基对细胞色素b5结构的影响,正确地揭示蛋白质相互作用的本质和机理,本文对牛肝微粒体细胞色素b5胰蛋白酶切割后水溶性部分的突变体(E44A/E48A/E56A/D60A)深液结构进行了研究.     

细胞色素b5 S64X突变体对蛋白结构及稳定性的影响

为了深入了解细胞色素b₅(Cyt b₅)64位氨基酸残基(Ser64)对血红素辅基微环境及蛋白性质的影响,我们分别对Cyt b₅ Ser64进行了保守性突变(S64T)以及非保守性突变(S64K、S64N和S64H),均为亲水性氨基酸残基。对野生型细胞色素b₅及其突变体蛋白S64X(X：T,K,N或H)的热、酸、盐酸胍变性的稳定性研究表明：4个突变体蛋白的稳定性相对于野生型都大大降低了;CD光谱表明,细胞色素b₅ S64X突变体中的α-螺旋明显减少,芳香性氨基酸残基所处的肽链结构受到了影响;盐酸胍变性荧光光谱表明,Trp22周围的蛋白肽链受到了影响,Trp22暴露于水溶液的程度加大。我们认为Ser64不仅对血红素辅基有稳定作用,同时还对维持蛋白Core 1中的第5个α-螺旋结构有重要的作用,在64位引入其他氨基酸残基影响了第5个α-螺旋的结构,并通过蛋白肽链的相互作用,使得Trp22所在的Core 2结构也受到了较为明显的扰动。     

光卟啉(YHPD)光敏作用的分子机制——YHPD对蛋白质微观光敏损伤的激光喇曼光谱研究

本文用已确定空间结构的溶菌酶为对象,采用可同时探测其主、侧链各基团变化的激光喇曼光谱技术,研究了YHPD对蛋白质空间结构的微观光敏损伤,获得以下新结果:(1)除5种已经发表的氨基酸(Trp,Tyr,Met,1/2 Cys和 His)外,还有苯丙氨酸和胱氨酸亦受到了光敏损伤;(2)定出氨基酸各基团对光敏作用敏感的次序;(3)被“埋藏”在蛋白质三维结构内部的色氨酸和酪氨酸也受到较强的损伤;(4)蛋白质的主链构象亦发生了明显的变化,有序结构(α-螺旋、β-折叠、β-回折)减少,无规卷曲增加.     

表面带负电荷氨基酸残基的突变对细胞色素b5与细胞色素c结合和识别的影响

利用核磁共振方法研究表面带不同负电荷氨基酸残基突变后的细胞色素b₅与细胞色素c的结合与识别.结果表明,静电作用在细胞色素b₅与细胞色素c的结合过程中有着重要的贡献,而且这些静电贡献在一定程度上具有累加性,E48的贡献略大于E44.同时还证明Browniandynamicssimulations优化出的Glu48-Lys13,Glu56-Lys₈₇,Asp60-Lys86和heme6-propionate-Tml₇₂(细胞色素b₅的残基排在前面)的结合方式在溶液中的确存在.细胞色素b₅突变体(E48,E56/A,D60/A)及[Cr(oxalate)₃]^3-对细胞色素c的表面结合竞争实验表明,细胞色素c表面结合区Site仍然同细胞色素b₅突变体(E48,E56/A,D60/A)有结合作用,只是结合强度上相对于野生细胞色素b₅同细胞色素c的结合有所降低.这表明除上述的Brownian dynamics simulations模型外,尚有其它如Salemme模型等的结合方式,这也揭示出细胞色素b₅和细胞色素c之间的结合是比较动态的.     

微过氧化物酶水溶液的ABEEM/MM动力学模拟

应用原子-键电负性均衡浮动电荷分子力场(ABEEM/MM), 对微过氧化物酶水溶液进行了分子动力学模拟. 研究了水溶液对微过氧化物酶的结构, 血红素的皱裂构象以及轴配体咪唑基的取向的影响. 结果表明, 在水溶液中微过氧化物酶的骨架氨基酸是稳定的, 而血红素的皱裂构象在水分子的作用下趋于平面. 与血红素轴配体咪唑基键连的组氨酸决定着咪唑基的空间取向, 而咪唑基与血红素侧链的丙酸基的静电作用对其取向仅起次要作用.     

蚕丝蛋白用于分离富集细胞色素c的研究

近年来,固相萃取被广泛用于蛋白质分离富集,萃取剂包括离子交换树脂~([1]),纳米材料~([2]),印迹材料~([3]).蚕丝是一种天然蛋白纤维~([4]),表面含氨基、醇羟基、酚羟基等官能团,是分离富集的有效载体.实验研究了蚕丝蛋白与血红素蛋白的相互作用,发现其对血红蛋白和细胞色素c表现完全不同的吸附,即在一定条件下血红蛋白不被吸附,而细胞色素c则被完全吸附.据此建立了选择性分离细胞色素c的新体系.