用顺序注射系统控制微流控芯片中的Edman降解

用顺序注射系统控制微流控芯片中的Edman降解反应, 提高了Edman降解的自动化程度, 得到蛋白质或多肽N-端氨基酸残基结构的准确信息. 对固体吸附材料的选择、顺序注射程序的设计和优化及影响Edman降解反应的因素进行了讨论. 该控制技术在蛋白质组学的研究中有一定的应用前景.     

基于生物质谱技术的磷酰化修饰策略在多肽测序中的应用

该文建立了一种利用磷酰化修饰结合电喷雾质谱(ESI-Q-TOF)测定多肽氨基酸序列的有效方法。利用Atherton-Todd反应,以二丙基亚磷酰酯(DPP)为磷酰化试剂,应用生物质谱技术,对磷酰化修饰后的5种模型肽的磷酰化反应情况进行了系统研究,考察了磷酰化肽的二级质谱特征,并与未经磷酰化反应的肽的二级质谱特征对比。结果表明,经过磷酰化修饰后,肽的二级质谱中的a1离子信号强度明显增加,可以准确鉴定其N端氨基酸;b系列离子信息完整,信号强度增强,使得多肽C ID测序的谱图简单、清晰,有利于肽的氨基酸序列的测定;赖氨酸(K,128.10 u)和谷氨酰胺(Q,128.13 u)两种氨基酸质荷比相近,由于二者磷酰化修饰后的差异性,使其得到准确区分。经过5种已知氨基酸序列的模型肽的磷酰化后结合质谱技术进行氨基酸序列测定验证,结果表明该方法简单、快速、准确,提高了利用质谱技术进行多肽测序的准确度和灵敏度,可为蛋白质组学研究提供有效的技术手段。     

氨基酸的异硫氰酸苯酯衍生物在聚酰胺薄膜上的薄层色谱定量分析

以异硫氰酸苯酯(PITC)进行Edman降解,用于多肽和蛋白质的序列鉴定已有卅年的历史,现已有很多方法用于鉴定所得到的PTH-氨基酸衍生物。除气体色谱、高压液体色谱外,利用硅胶G的薄层色谱可以进行定性、定量分析。有的作者在聚酰胺薄膜上进行过定性分析。本文叙述了在聚酰胺薄膜上进行PTH-氨基酸薄层色谱半定量分析的方法,使用色谱扫描仪直接测出色谱点的相对面积,使定量分析工作快速、简便。     

产物可用电喷雾质谱检测的氨基酸/肽季铵化新方法

氨基酸和肽中氨基的化学修饰反应,如乙酰化反应和烷基化反应已被广泛用于蛋白组学研究中蛋白质的定量分析．氨基酸和肽的季铵化产物具有独特的优点,在电喷雾质谱中具有很好的离子化效率,可大大提高检测的灵敏度．文献[6～8]报道的氨基酸和肽的季铵化方法均使用高浓度的盐(如KHCO3),严重影响了质谱的检测结果,难以直接用于蛋白质组学研究．     

PTH-氨基酸的高压液相色谱分离

蛋白质和多肽是由各种氨基酸通过肽键相连而成,要阐明蛋白质的一级结构需先将其序列降解,然后测定依次降解出来的氨基酸。通常用Edman方法来降解蛋白质N-端氨基酸,使生成苯基海硫因氨基酸(简称PTH-氨基酸),而鉴定PTH-氨基酸常用的方法是气相色谱、薄层色谱和将降解生成的PTH-氨基酸再水解测定氨基酸的方法。近几年来,用高压液相色     

低浓度甲醛对多肽和蛋白化学修饰的质谱研究

采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱( MALDI-TOF MS)和纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质谱( Nano-ESI -QTOF MS)技术,以标准肽段和流感病毒基质蛋白酶切肽段为模型,研究了甲醛对蛋白质和多肽主链的修饰作用。采用与实际病毒灭活过程一致的实验条件(4℃,0.025%(V/V)福尔马林(37%(w/w)甲醛溶液)处理72 h),进行甲醛与多肽的化学反应。结果表明,在实验条件下,甲醛能与标准肽段N端的氨基反应生成羟甲基加合物,再发生缩合反应生成亚胺,形成+12 Da的产物。此外,甲醛还能与标准肽段中的精氨酸、赖氨酸的侧链发生反应,生成+12 Da的反应产物。对流感病毒基质蛋白的酶切肽段与甲醛的反应的质谱分析结果显示,多数的肽段都生成了+24 Da的产物,质量的增加来源于肽段N端氨基(+12 Da)和C端精氨酸或赖氨酸的侧链(+12 Da)的贡献。此外,还观察到有一个漏切位点的肽段生成了+36 Da的产物。本研究结果表明,在实验条件下,低浓度甲醛主要与肽段和蛋白的N 端氨基,以及精氨酸和赖氨酸侧链发生反应。本研究为分析低浓度甲醛与蛋白质的反应产物提供了有效的质谱分析方法和解谱依据。     

酶切过程中肽段过烷基化对蛋白质定性和定量分析的影响

蛋白质的还原-烷基化是蛋白质酶切中的重要步骤,常用的烷基化试剂是碘乙酰胺(IAA),但是IAA除了和半胱氨酸发生反应,也可能和其他多种氨基酸发生副反应。我们模拟常规的酶切条件,系统地研究了蛋白质真实酶切时所有酶切肽段发生烷基化的情况。结果表明,多种氨基酸可以发生烷基化,其趋势为:半胱氨酸>肽段N端氨基酸>天冬氨酸>谷氨酸>组氨酸>天冬酰胺>赖氨酸>酪氨酸,同时也发现同一肽段上的氨基酸烷基化具有排他性和聚集性。根据定性结果,采用质谱多反应监测(MRM)技术对多个肽段进行了定量分析,评估了过烷基化对蛋白质定量分析的影响。该研究结果表明,过量的烷基化修饰对蛋白质的定性与定量分析都可能产生较大影响。在蛋白质组学研究的样本处理流程中,应避免样本的过烷基化。     

色谱保留时间在蛋白质组研究中的应用

液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)技术是蛋白质组学研究中的常见方法。保留时间作为独立于质谱信息的参数已经被用于蛋白质的鉴定和定量工作中。在多肽鉴定领域,多肽的色谱保留时间预测与常规的二级串联质谱数据库搜索算法结合可以提高鉴定的可信度。鉴定的灵敏度也可以通过匹配多次LC-MS实验中具有相同精确质量数和保留时间的峰而提高。另一方面,由于色谱条件的微小改变即会引起保留时间的变化,因此对多次实验结果进行保留时间比对是进行非标记定量的不可或缺的步骤。另外,联合保留时间偏移和质量数信息还可以进行蛋白质翻译后修饰(post-translational modification, PTM)的鉴定。     

肽段化学衍生技术及其在质谱高灵敏度鉴定中的应用进展

鸟枪法串联质谱蛋白质鉴定是蛋白质组学研究中广泛采用的策略。然而,蛋白质组样品的高复杂性、宽动态范围分布使得低丰度肽段以及难于离子化肽段的质谱检测仍然存在着巨大的挑战。为了提高质谱检测灵敏度,通过化学衍生技术在多肽中引入易于离子化的小分子标签的方法获得了广泛关注。本文综述了近年来应用于多肽及其翻译后修饰的化学衍生试剂,侧重其在高灵敏度质谱分析中的应用进展,并展望了化学衍生技术的发展方向及其在蛋白质组学中的应用前景。     

基质辅助激光解析电离质谱用于多肽和蛋白质亚硝基化修饰研究

亚硝基阴离子是生物体内重要的生物调控小分子,广泛分布于生物体的血液和组织中,能使蛋白质发生硝基化和亚硝基化修饰,并且调控生物体的多种生理过程.本研究应用高灵敏度的基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS)技术,以合成的标准肽段和肌红蛋白为模型系统.研究了蛋白质和多肽主链N端氨基与赖氨酸侧链氨基对HNO2反应的敏感性,并考察了反应体系和不同的反应时间对HNO2与多肽的反应完全程度的影响.结果表明,HNO2能与肽段N端的伯氨基发生重氮化反应,形成的叠氮化中间产物不稳定,放出氮气形成碳正离子,碳正离子可进一步发生取代或消除反应.发生取代反应,水溶液中的羟基取代N-末端氨基形成M+1产物,既使得产物比原肽段分子量多1 Da;发生消除反应,脱掉1分子的氨,又生成M-17烯烃衍生物,从而使产物比原肽段分子量少17 Da.当采用1 mol/L乙酸和1 mol/L的亚硝酸钠作为反应体系时,反应5 min, 肽段的N端氨基即可完全与HNO2反应生成羟基取代产物和烯烃衍生物.而在上述条件下,未发现赖氨酸侧链氨基与HNO2反应,说明HNO2主要与肽段和蛋白的N端氨基发生反应.     

Applications of Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) in Protein Analysis for Biomedical Research

Mass Spectrometry (MS) allows the analysis of proteins and peptides through a variety of methods, such as Electrospray Ionization-Mass Spectrometry (ESI-MS) or Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry (MALDI-MS). These methods allow identification of the mass of a protein or a peptide as intact molecules or the identification of a protein through peptide-mass fingerprinting generated upon enzymatic digestion. Tandem mass spectrometry (MS/MS) allows the fragmentation of proteins and peptides to determine the amino acid sequence of proteins (top-down and middle-down proteomics) and peptides (bottom-up proteomics). Furthermore, tandem mass spectrometry also allows the identification of post-translational modifications (PTMs) of proteins and peptides. Here, we discuss the application of MS/MS in biomedical research, indicating specific examples for the identification of proteins or peptides and their PTMs as relevant biomarkers for diagnostic and therapy.     

栝楼蛋白 2: 栝楼蛋白部分化学结构的初步测定

栝楼蛋白(Trichobitacin)是从栝楼(Trichosanthes kirilowiiMaxim, Cucurbitaceae)中新发现的核糖体失活蛋白, 分子量为27,228; pI为9.6。应用基质辅助的激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和快原子轰击质谱法(FAB-MS)分别测定胰蛋白酶酶解栝楼蛋白和天花粉蛋白(Trichosanthin)的混合肽质谱, 通过比较发现了一些分子量相同的肽。由于这两种蛋白质都来源于栝楼块根, 同源性比较强, 所以这些肽序列在两种蛋白质中基本一样; 再结合蛋白N-端自动顺序仪测定栝楼蛋白N-端的结果, 确定了栝楼蛋白N-端38个氨基酸的顺序, 栝楼蛋白经胰蛋白酶酶解后所得肽段用HPLC分离纯化, 再用蛋白质自动顺序仪, DABITC/PITC双偶合手工法和质谱法共确定了栝楼蛋白N-端, C-端等100多个氨基酸残基的序列。     

超高效液相色谱-串联质谱法定性和高效液相色谱法定量分析天南星中氨基酸成分

为建立中药材中氨基类极性非紫外活性成分的定性与定量分析方法,以中药材天南星为研究对象,采用柱前衍生化技术,以异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生化试剂,经C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm)分离和超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析,共解析了天南星中20个成分,包括18个氨基酸和2个胺类化合物。经优化衍生化条件,应用高效液相色谱法(HPLC),以Diamonsil C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)分离,以乙腈和0.05 mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液(pH 6.5)为流动相,梯度洗脱,在254 nm下检测,建立了同时测定15种氨基酸含量的方法,经方法学考察符合含量测定要求。谷氨酸、色氨酸在2~100 mg/L范围内、精氨酸在6~300 mg/L范围内、其余各氨基酸在0.8~40 mg/L范围内均呈良好的线性关系,相关系数均不小于0.9995;平均回收率在95%~105%之间,RSD均小于3%;并成功应用于12批中药材的测定。本方法简便、灵敏、准确,具有可操作性,可用于快速鉴定中药中的氨基类成分以及进行含量测定。     

反相高效液相色谱/基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 分离鉴定螺蛳血管紧张素转换酶抑制肽

运用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对酶解螺蛳腹足肌得到的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽进行两步分离提纯,第一步主要得到8个组分;选取其中活性最高的组分进一步分离,得到2个组分,其中活性较高组分的ACE半抑制浓度为43.5 μmol/L,基本为单一肽组分。对提纯的组分分别使用高效液相色谱/电喷雾离子质谱法(HPLC/ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)进行分析,同时结合氨基酸组成分析结果,最终得到的肽链一级结构为Lys-Glu-Ile-Trp(KEIW),符合已知的高活性ACE抑制肽的结构规律。经过对两种方法分析过程的比较,认为ESI-MS可以得到多方面的信息,但无法确定肽的序列;MALDI-TOF MS可以得到精确的二级质谱图(m/z精确至0.0001),从而可以得到确定的肽的序列。     

Applications of MALDI-MS/MS-Based Proteomics in Biomedical Research

Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) is one of the most widely used techniques in proteomics to achieve structural identification and characterization of proteins and peptides, including their variety of proteoforms due to post-translational modifications (PTMs) or protein–protein interactions (PPIs). MALDI-MS and MALDI tandem mass spectrometry (MS/MS) have been developed as analytical techniques to study small and large molecules, offering picomole to femtomole sensitivity and enabling the direct analysis of biological samples, such as biofluids, solid tissues, tissue/cell homogenates, and cell culture lysates, with a minimized procedure of sample preparation. In the last decades, structural identification of peptides and proteins achieved by MALDI-MS/MS helped researchers and clinicians to decipher molecular function, biological process, cellular component, and related pathways of the gene products as well as their involvement in pathogenesis of diseases. In this review, we highlight the applications of MALDI ionization source and tandem approaches for MS for analyzing biomedical relevant peptides and proteins. Furthermore, one of the most relevant applications of MALDI-MS/MS is to provide “molecular pictures”, which offer in situ information about molecular weight proteins without labeling of potential targets. Histology-directed MALDI-mass spectrometry imaging (MSI) uses MALDI-ToF/ToF or other MALDI tandem mass spectrometers for accurate sequence analysis of peptide biomarkers and biological active compounds directly in tissues, to assure complementary and essential spatial data compared with those obtained by LC-ESI-MS/MS technique.     

氨基酸-稳定同位素稀释质谱法用于合成肽段准确含量分析

建立了氨基酸同位素稀释液相色谱-串联质谱法准确测定合成肽段绝对含量的方法。实验中对合成肽段的纯度进行了表征,色谱纯度表征结果为99%以上,质谱纯度为90%以上。在肽段溶液中加入13C标记的氨基酸后进行酸溶液水解时间的优化,水解后的氨基酸直接经液相色谱分离和质谱检测,结果表明肽段中的被测氨基酸在150 ℃、6 mol/L HCl溶液水解4～6 h就可以达到水解平衡。每个肽段选择两个或两个以上的被测氨基酸,测得随机选择的5种合成肽段的绝对含量为62.07%～88.18%,测定结果的相对标准偏差小于8%,相对误差小于5%,均满足定量要求。除常用的被测氨基酸苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸外,还考察了选择赖氨酸和精氨酸作为被测氨基酸的可行性,实验结果表明增加精氨酸为被测氨基酸是可行的,从而进一步增加了方法的普适性。该方法的建立避免了色谱法定量时氨基酸衍生化处理带来的副反应影响及操作繁琐等问题,提高了肽段含量测定的准确度和精密度,为肽段含量的准确测定提供了一种新的方法。     

马氏钳蝎蝎毒短肽BmK622的分离纯化和一级结构测定

应用凝胶过滤、离子交换和HPLC反相色谱法从马氏蝎粗毒中分离纯化得到蝎毒 多肽BmK622．联合运用串联质谱法和Edman降解法，鉴定了KmK622N端19个残基的序 列，经过数据库检索，发现数据库中用cDNA克隆方法鉴定了序列的马氏钳蝎蝎毒短 肽BmTX3一级序列N端19个残基与BmK622已测定的N端19个残基序列完全相同， BmK622的分子量测定和氨基酸组成分折的结果表明，BmK22与BmTX3分子量相同、氨 基酸组成一致，从而BmK22的一级结构为：GFLID VKCFA SSECW TACKK VTGSG QGKCQ NNQCR CY．     

依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法的建立及其初步应用

建立了依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法,并与非依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱分析方法对不同体系(牛血清白蛋白酶切物、6种标准蛋白质混合物酶切物、腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)的分析结果进行了系统比较。结果表明,引入色谱保留时间后的智能化选择反应监测质谱方法能够显著提高肽段及蛋白质的鉴定量,并且在复杂体系（如腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物）中效果尤为明显,鉴定到的肽段及蛋白质的覆盖率可分别达到目标肽段和蛋白质数量的89.62%和92.41%,并且灵敏度高、重复性好,能够实现对质荷比相同但保留时间有差异的肽段的准确鉴定。该方法将在复杂生物样本目标蛋白质组高通量、高灵敏度的鉴定、验证和确认中发挥独特作用。     

Direct Identification of Urinary Tract Pathogens by MALDI-TOF/TOF Analysis and De Novo Peptide Sequencing

For mass spectrometry-based diagnostics of microorganisms, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is currently routinely used to identify urinary tract pathogens. However, it requires a lengthy culture step for accurate pathogen identification, and is limited by a relatively small number of available species in peptide spectral libraries (≤3329). Here, we propose a method for pathogen identification that overcomes the above limitations, and utilizes the MALDI-TOF/TOF MS instrument. Tandem mass spectra of the analyzed peptides were obtained by chemically activated fragmentation, which allowed mass spectrometry analysis in negative and positive ion modes. Peptide sequences were elucidated de novo, and aligned with the non-redundant National Center for Biotechnology Information Reference Sequence Database (NCBInr). For data analysis, we developed a custom program package that predicted peptide sequences from the negative and positive MS/MS spectra. The main advantage of this method over a conventional MALDI-TOF MS peptide analysis is identification in less than 24 h without a cultivation step. Compared to the limited identification with peptide spectra libraries, the NCBI database derived from genome sequencing currently contains 20,917 bacterial species, and is constantly expanding. This paper presents an accurate method that is used to identify pathogens grown on agar plates, and those isolated directly from urine samples, with high accuracy.