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相似文献
 共查询到18条相似文献,搜索用时 531 毫秒
1.
本研究构建UK蛋白的原核表达载体pET28-UK,转化BL21宿主菌,经过IPTG诱导、表达、纯化,获取UK蛋白,制备抗原,免疫杭州大耳白兔.经过3次免疫后心脏采血,吸取血清作为抗体.经过ELISA和免疫荧光试验验证,陔抗体町以识别机体UK蛋白.本研究为深入阐明HBx与UK蛋白的相互作用的功能性试验,以及完全阐明UK蛋白在细胞内的功能奠定了基础.  相似文献   

2.
与HBV X蛋白相互作用的细胞蛋白的筛选及其鉴定   总被引:1,自引:1,他引:0  
参考GenBank核苷酸序列库中的HBV的核苷酸序列设计合成了一对对应于HBx基因的引物,从原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者的血清中提取HBV基因组DNA作为模板,扩增HBx编码区并测定了核苷酸序列.将该编码区克隆到酵母双杂交系统的诱饵蛋白表达载体pGBKT7中,转入酵母细胞AH109,进行表型鉴定.然后通过Mating实验从已制备好用于酵母双杂交系统的肝cDNA表达文库中筛选与HBx相互作用的细胞蛋白,并用体外免疫共沉淀实验进一步验证.研究表明,分离得到的与HBx基因编码的蛋白相互作用的4种新的细胞蛋白,分别是醛缩酶B、C8α亚基、一种丝氨酸蛋白酶Hepsin和一种未知蛋白.  相似文献   

3.
PCR扩增金黄色葡萄球菌蛋白A基因spa,通过酶切位点的转换构建重组质粒pET-spa,进一步成功构建能表达融合蛋白SPA-CpcB的质粒pET-spa-cpcB.将重组质粒pET-spa-cpcB与在大肠杆菌内生成藻胆色素必需的质粒,以及藻胆蛋白裂合酶质粒,共同转入大肠杆菌BL21(DE3)内,进行体内重组,生物合成融合色素蛋白.蛋白质电泳以及锌染色结果表明,体内重组分别获得了融合色素蛋白SPA-CpcB-PCB或SPA-CpcB-PEB.吸收光谱与荧光光谱结果表明,融合色素蛋白SPA-CpcB-PCB或SPA-CpcB-PEB具有与CpcB-PCB或CpcB-PEB相同的光谱特征.将SPA-CpcB-PEB与生物素标记的兔抗体进行荧光免疫反应,通过多功能微孔板荧光检测仪检测,结果表明融合色素蛋白SPA-CpcB-PEB具有SPA能与多种哺乳动物血清中的IgG的Fc段结合的特点.利用SPA-CpcB-PEB来检测包被于聚苯乙烯微量反应板的基因编码为all5292的蛋白,证实了该融合色素蛋白可用于免疫检测.  相似文献   

4.
将乙肝病毒(HBV)ayw株完整的X基因正向重组到原核表达质粒pBV-221的PL启动子下游,得到能表达X蛋白的重组质粒pBV-HBV(+);同时将X基因反向重组到原核表达质粒pBV-220的PL启动子下游,得到能转录X基因反义RNA的重组质粒pBV-HBX(-).利用这两个质粒,构建出能同时转录X基因mRNA和反义RNA的重组质粒PEX.AN-HBX,并在原核水平上,证实了反义RNA对X基因的表达具有明显的抑制作用,从而为在真核水平上利用反义RNA对X基因进行调控的研究提供了有利的基础.  相似文献   

5.
以猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA克隆pT7SM为模板,PCR扩增CSFV ns3基因N末端截短的cDNA片段.PCR产物经限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切消化后,克隆到经BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-ΔNS3,转化E.coli BL21-codonPlus (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达.采用SDS-PAGE分离纯化非结构蛋白3(NS3)重组蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体.ELISA法及间接免疫荧光检测结果显示,该多克隆抗体效价在1×105以上,能分别与在大肠杆菌中表达的NS3重组蛋白或CSFV感染细胞中表达的NS3天然蛋白发生特异性结合反应.制备的NS3重组蛋白可用作建立NS3抗体ELISA检测方法的包被抗原 ;NS3抗体可用于检测CSFV病毒感染和NS3功能研究中的蛋白质鉴定.  相似文献   

6.
表达纯化梅毒螺旋体重组融合蛋白,研究其抗原性和免疫原性,为梅毒诊断试剂和疫苗研究提供新候选抗原。合成梅毒螺旋体重组融合蛋白Tp0453-TpF1-Tp0965基因,转入大肠杆菌中进行表达;镍柱纯化重组融合蛋白,western blot鉴定;以重组融合蛋白作为抗原,酶联免疫法(ELISA)检测人血清样本,分析其抗原性;利用该重组融合蛋白免疫新西兰兔,ELISA检测兔血清抗体滴度水平,评价其免疫原性。梅毒重组融合蛋白Tp0453-TpF1-Tp0965在工程菌中成功表达,分子量为50kD。重组融合蛋白可被梅毒抗体阳性的血清识别,梅毒阴性血清与蛋白无反应。使用重组融合蛋白作为抗原检测人血清梅毒抗体,梅毒患者样本组与非梅毒患者样本组的检测结果存在非常显著性差异。重组融合蛋白免疫兔后,兔血清中可持续检测到高滴度梅毒抗体。梅毒重组融合蛋白Tp0453-TpF1-Tp0965有良好的抗原性和免疫原性,可作为梅毒诊断试剂抗原和梅毒疫苗的候选蛋白。  相似文献   

7.
目的克隆假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法根据GenBank上登录的假结核耶尔森菌侵袭素蛋白核酸序列设计引物,用PCR方法扩增假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因,并将其插入克隆载体pMD18-T中,测序鉴定正确后再将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-inv.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测.结果假结核耶尔森菌提取的基因组,经PCR扩增,得到一段591 bp的片段,与预期结果一致;SDS-PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约46 kDa,与预期结果相同;重组菌体超声裂解后,经12%的SDS-PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为包涵体蛋白.结论克隆的侵袭素基因核心片段可以在原核细胞中高效表达.  相似文献   

8.
以禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)NA基因全长eDNA克隆pMD-NA为模板,PCR扩增第406位至第1353位基因片段。克隆到pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-28/ANA,转化大肠杆菌,用异丙基口硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot分析证实,截短的NA重组蛋白获得高效表达。采用SDS-PAGE纯化重组蛋白,免疫家兔,制备特异性神经氨酸酶(NA)抗体。ELISA及间接免疫荧光检测结果显示,该抗体效价在1:1×10^5以上,能与在大肠杆菌和Vero细胞中表达的NA蛋白产生特异性反应。纯化的NA重组蛋白可用作建立禽流感检测方法的诊断抗原,所制备NA抗体可用于检测禽流感基因工程疫苗中的NA抗原组分。  相似文献   

9.
构建第56位氨基酸发生突变的MEK1基因(MEK1/Q56P)与增强绿色荧光蛋白(EGFP)报道基因融合表达的真核重组质粒pEGFP-MEK1/Q56P,经限制性酶切及测序鉴定后,将其导入293T细胞中,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,同时进行Western blot检测。酶切鉴定及测序结果表明构建的pEGFP-MEK1/Q56P与预期结果一致,荧光观察及Western blot结果表明MEK1/Q56P和EGFP在293T细胞中能以融合蛋白的形式表达,且MEK1/Q56P能特异性活化ERK1/2,本研究成功构建了含有MEK1/Q56P的绿色荧光蛋白真核表达质粒,便于对Raf/MEK1/ERK1/2信号传导通路做进一步研究。  相似文献   

10.
本研究利用酵母Pichia pastoris真核表达系统表达人乳头瘤病毒16(HPVl6)E7蛋白,试图解决新疆维吾尔妇女高发宫颈癌的诊断、疫苗的研究中抗原蛋白需要的问题。依据新疆维吾尔妇女宫颈癌组织克隆获得的HPVl6—E7基因序列设计引物,并分别在5’引物和3’引物中引入了EcoR I和Xba I酵切位点,经RCR扩增后连接到pMDl8—T载体上,再将HPVl6—E7克隆至穿梭质粒pGAPZαA上,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA—E7经线性化后,采用UiCl法将重组穿梭质粒转入酵母细胞内,Zeocin 筛选阳性克隆,经小瓶发酵后,取上清作SDS-PAGE,并做Western印迹检测表达的蛋白质,结果表明HPVl6-E7成功地在酵母真核表达系统获得表达,表达产物的分子量分别是22KDa和88KDa,为深入开展HPVl6-E7蛋白功能和应用的研究奠定了理论基础。  相似文献   

11.
目的构建新疆家蚕抗菌肽(cecropin—XJ)基因的真核表达载体pEGFP—C1/cecropin—XJ(pEGFP—cec),检测其在肿瘤细胞中的表达情况,探讨抗菌肽对肿瘤细胞的作用机制和抗菌肽抑瘤作用效果.方法应用基因重组技术,将新疆家蚕抗菌肽(cecropin—XJ)基因克隆到真核表达载体pEGFP—C1,通过酶切和测序的方法鉴定重组质粒pEGFP—cec的正确性.将pEGFP—cec经脂质体法转染到胃癌细胞MGc80—3,48h后观察EGFP瞬时表达情况;72h后,应用RT—PCR,检测抗菌肽cecropin—XJ基因的表达;96h后,消化细胞,经台盼蓝染色,检测重组质粒pEGFP—cec表达产物对肿瘤细胞的影响.结果细胞转染48h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达,发出绿色荧光;转染72h后,RT—PCR检测到胞内有抗菌肽cecropin—XJ基因的表达;表达产物能够抑制肿瘤细胞的生长.结论成功构建了真核表达载体pEGFP—cec,并在肿瘤细胞中可见抗菌肽cecropin—XJ和EGFP基因的有效表达以及表达产物具有显著的抗肿瘤活性.为深入开展抗菌肽抑制肿瘤的研究奠定基础.  相似文献   

12.
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是诱发原发性肝癌的主要原因之一.HBV存在4个相互重叠的开放读码框:S,C,P和X区.其中X基因表达的蛋白HBx被认为是诱导肝癌发生的一种多功能致癌蛋白,它可以作用于众多信号通路及细胞因子从而诱发肝癌.本文根据最新的研究,选择其中p53和NF-κB两条信号通路及HBx与表观遗传修饰的相关性进行了探讨,目的在于部分揭示HBV感染诱发肝癌的发病机理.  相似文献   

13.
根据GeneBank中人乙醇脱氢酶ADH1B2基因序列设计引物,以人肝脏总RNA为模板,反转录获得人乙醇脱氢酶基因.将克隆基因与表达载体pPICZB连接,测序正确的pPICZB-ADH1B2电转化毕赤酵母GS115;重组毕赤酵母工程菌经0.5%(v/v)甲醇诱导72 h后目的蛋白以可溶形式表达,经DEAE-Sepharose FF纯化后蛋白酶活性可达8 000 U·mg-1.同时构建重组质粒pCDNA3.1-ADH1B2转染HepG2人肝癌细胞,发现细胞内ROS/GSH水平降低,Akt磷酸化水平降低,细胞活性下降.为临床酒精中毒预防和治疗药物的研发以及ADH在肝脏肿瘤方面的研究提供了理论基础.  相似文献   

14.
用AcNPV穿梭载体Ac-Bacmid与野生型BmNPVDNA共转染家蚕BmN细胞,通过同源重组得到整合了lacZ/Tn7at/miniF表达盒的BmNPVBacmid,除能在大肠杆菌/BmN细胞中穿梭复制外,还能感染BmN-PV的非允许细胞Sf9,成功地构建了BmNPV的双穿梭载体.经与重组转座质粒pFGHe转座,获得了插入gfp/HBVe融合基因的重组rBm-Bacmid(rBmGHe),在家蚕细胞中表达了既能发射绿色荧光又具有HBeAg抗原性的双功能融合蛋白.Bm-Bacmid为杆状病毒BactoBac策略增添了一个新成员  相似文献   

15.
用反转录PCR的方法,从BALB/c小鼠脾细胞中扩增出B7-1cDNA后,插入pcDNA3质粒中构建成小鼠B7-1cDNA的真核表达载体pCD-mB7.1,经酶切鉴定和序列分析证实此表达载体中插入的B7-1cDNA的序列与文献报道一致.通过脂质体介导将pCD-mB7.1导入B7-1的小鼠黑色素瘤细胞系B16(F0)中,经RT-PCR和RNA斑点杂交初步证实B7-1在肿瘤细胞中获得了稳定有效的表达.同源小鼠脾淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养后采用LDH释放改良法测定淋巴细胞特异杀伤活性,结果显示,与野生型和模拟转染的B16细胞相比,B7-1基因转染的B16细胞能较有效诱导淋巴细胞产生针对野生型B16细胞的特异杀伤活性(p<0.02).这说明,将B7-1基因导入肿瘤细胞表达能提高其免疫原性,诱导有效的抗肿瘤免疫反应  相似文献   

16.
成功的构建了棉铃虫细胞(Hz-AM1)的cDNA文库(Ha-cDNA),然后以棉铃虫核型多角体病毒衣壳蛋白VP39(HaNPV-VP39)作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system),在棉铃虫细胞cDNA文库中钓到了VP39的相互作用因子基因,通过DNA测序和氨基酸序列分析表明,该基因为棉铃虫的肌动蛋白(actin)基因,本实验从一个侧面反映了VP39蛋白与棉铃虫肌动蛋白间的相互作用。  相似文献   

17.
采用PCR技术获得了新型的人肿瘤坏死因子基因,在153位氨基酸处引入突变,使Gly突变为Leu.将突变体hTNF基因克隆到表达载体pQE30中,SDS-PAGE结果显示经IPTG诱导后,hTNF基因获得大量表达.通过Ni金属鳌合层析柱亲和层析获得到纯化的hTNF融合蛋白,Westernblot结果表明hTNF蛋白可与抗TNF的抗血清发生特异性反应.荧光染色实验检测了hTNF蛋白诱导细胞发生凋亡的活性.  相似文献   

18.
丙型肝炎病毒NS5B基因在昆虫细胞中的表达   总被引:6,自引:0,他引:6  
将含有丙型肝炎病毒(HCV)NS5B基因的转移载体pBlueBac5B与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染Sf9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5B基因的重组病毒AcNS5B.提取重组病毒基因组DNA进行Southern分析,发现有一条1.8kb的DNA片段与标记的探针发生杂交.AcNS5B感染Sf9细胞后,在细胞中表达了分子量为66×103的蛋白,用Westernblot方法检查这种蛋白质,能与兔抗HCVNS5B抗血清发生特异的强烈反应.  相似文献   

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