鼠白细胞介素2真核表达质粒的构建及鉴定

利用小鼠IL－2基因构建真核表达质粒,筛选的阳性克隆经限制性内切酶酶切鉴定和基因测序,结果表明小鼠IL－2基因被正确地克隆支pCDNA3真核表达质粒上,将真核心质粒pCDNA2IL-2,转化大肠杆菌细胞,增菌培养后大量提取pCDNA3IL-2质粒,经紫外分光光度计检测其纯度和浓度,为加强控制害DNA疫苗的免疫功能奠定了科学的理论基础。     

含蚕豆核酮糖1，5一二磷羧酶化/加氧酶大亚基基因的重组质粒物理图谱的构建

pVFB33为含蚕豆叶绿沐核酮糖M J一二磷酸趁化酶/un氧酶大亚基基因的克隆.本实验采用碱变性法，提取、分离和纯化了pVFD33质粒DNA,并利用几种限制性内切酶酶解，构建了pVFB33质粒DNA的物理图谱.同时，对实脸结果进行了分析讨论.     

含蚕豆核酮糖1,5-二磷酸羧酶化/加氧酶大亚基基因的重组质粒物理图谱的构建

pVFB33为含蚕豆叶绿体核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因的克隆.本实验采用碱变性法,提取、分离和纯化了pVFB33质粒DNA,并利用几种限制性内切酶酶解,构建了pVFB33质粒DNA的物理图谱,同时,对实验结果进行了分析讨论.     

基于PhiX174基因E介导的遗传灭活多杀性巴氏杆菌

采用基因工程方法,将PhiX174噬菌体裂解基因E和温敏控制表达系统与质粒pPBA1100基因杂交,构建了重组子pPBA1100-E。将重组子转化到多杀性巴氏杆菌中,通过温度诱导使裂解基因表达。用限制性内切酶检验重组子,扫描电镜观察多杀性巴氏杆菌细菌幽灵和菌落形成单位评价遗传灭活率。结果表明:重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定,琼脂糖电泳呈现3条谱带,分子量与理论值一致;扫描电镜观察表明,重组子在多杀性巴氏杆菌中成功表达,获得了细菌幽灵;菌落形成单位检验结果显示,多杀性巴氏杆菌遗传灭活率达到99%。为制备天然细菌外膜蛋白抗原疫苗提供技术依据。     

具有真细菌基因启动子活性的古生菌DNA片段

以大肠杆菌启动子探测质粒pKK232-8 为载体,用4 组限制性内切酶分别消化古生菌盐生盐杆菌R1(Halobacterium halobium )的染色体DNA,在体外进行重组,转化E.coliDH-5α感受态细胞,得到12 个转化子(T1～T12),其抗性水平分布在10～500 m g/L的区间内. 将这些转化子所含质粒分别命名为pSX1～pSX12,限制性酶切分析表明,这些质粒各插入了一段不同的外源DNA 片段,杂交分析表明,抗性最强的转化子T11 所含质粒pSX11 上插入了一段来源于盐生盐杆菌R1 染色体的DNA 片段. 该DNA 片段在大肠杆菌中具有启动子功能.     

嗜麦芽假单胞菌质粒pSH1的限制图谱及km~r标记的克隆

对嗜麦芽假单胞菌Ｐ２菌株（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｏｈｉｌｉａＰ２）的质粒ｐＳＨ１进行了限制酶切分析，确定了ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ、ＸｂａⅠ、ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅠ、及ＰｖｕⅡ共７种限制性内切酶在ｐＳＨ１、质粒上的切割位点，前４种酶均为单一切点；后３种依次为２、７、５个切点．通过双酶切和部分酶切的方法绘制了ｐＳＨ１质粒的限制酶切图谱．将ｐＧＰ１－２质粒上的卡那霉素抗性基因（ｋｍｒ）片段插入ｐＳＨ１，获得了重组质粒ｐＳＨ２．ｐＳＨ２是由ｐＧＰ１－２质粒上大小为２．９０ｋｂ的ＤＮＡ片段（含ｋｍｒ）和ｇｈＨ１经ＢａｍＨⅠ－ＰｓｔⅠ双酶切产生５．７０ｋｂ大片段组成，它能够重新转化到喀麦芽假单胞菌受体（ｋｍｒ）中，其ｋｍｒ标记能够得到稳定的表达．     

嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的克隆及其表达

报导了以启动子探测质粒pKK232-8为载体克隆嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的研究.用限制性内切酶Hindl分别消化嗜碱芽孢杆菌NTT89染色体DNA和质粒pKK232-8,在体外重组,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,在含氨苄青霉素和氯霉素的选择性平板上筛选转化子,结果从NTT89染色体DNA中克隆到一系列带有启动子活性的DNA片段,并在大肠杆菌中得到表达,这些转化子抗氯霉素水平在34～500mg/L不等,随机挑选10个转化子,提取其重组质粒进行限制性酶切,表明转化子中的重组质粒外源片段插入的效率很高,插入片段大小在500～5500bp之间,通过地高辛标记的点杂交和Southern杂交均证明重组质粒上插入的具启动子功能的DNA片段来自于嗜碱芽孢杆菌的染色体DNA.     

含水稻rbcL重组质粒限制图谱的构建

从水稻叶绿体羞因文库中挑选含rbcL荃因的3号克隆，采用大t煮沸法，分离纯化了质粒DNA.利用限制性核酸内切醉BamH I ,Sma I ,Xho I和Cla I进行单酶或双酶切，在BamH I限制图谱的羞础上构建了几种限制醉的限制图谱.     

rbcL基因在水稻叶绿体DNA基因库克隆中的定位

由水稻品系珍汕９７不育系为材料制得的叶绿体ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）基因库中，筛选到屯含核酮糖１，５－二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基基因（ｒｂｃＬ）的重组质粒，对该重组质粒用ＰｖｕⅡ，Ｐｓｔ１ｔ和ＳａｌＩ限制性内切酶进行了分析并制得了限制图谱，ｒｂｃＬ基因在该图谱上进行了定位。     

重组pQE30 tPAr质粒在JM109菌株中的稳定性研究

将构建好的含有人变异tPA基因的重组pQE30 tPAr质粒的JM109菌株原始种子库菌种，在含Amp的平板培养基划线法连续传代至100代，其在固体培养基中生长速度、菌落形态和菌体形态、Amp抗性等方面与原始种子库无明显差异；每隔10代提取质粒DNA用HindⅢ和KpnⅠ限制性内切酶切割检查，酶切图谱没有改变；DNA测序未见tPAr基因变异．用原代和第100代培养诱导表达tPAr,表达水平和tPAr活性均无明显差异．菌体的SDS-pAGE图谱也完全相同．以上结果表明所建立的JM109tPAr工程菌株具有良好的遗传稳定性．     

氯化铯密度梯度离心法纯化叶绿体DNA

本方法用蔗糖密度梯度离心分离烟草及油菜纯化的叶绿体,然后用氯化铯密度梯度超速离心纯化叶绿体DNA.不加DNase处理,但从限制性核酸内切酶作用,经琼脂糖凝胶电泳得到的比较清晰的限制图谱,产物可用于制作物理图谱和DNA重组合.     

eglinC基因的化学合成与克隆

采用固相亚磷酰胺法合成了ｅｇｌｉｎＣ全基因，该基因全长２２１ｂｐ，包括其结构基因，５＇－端起始密码子ＡＴＧ和３＇－端终止密码子ＴＡＧ，并在基因的５＇－和３＇－分别装上ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ位点．共分１２个片段，采取分段合成，酶促连接成完整的ｅｇｌｉｎＣ基因．合成的基因克隆于Ｍ１３载体，经杂交、检测，筛选出含ｅｇｌｉｎＣ基因的克隆．用双脱氧链终止法测其序列，结果与设计的一致．     

微量热技术检测古生菌启动子DNA片段的启动功能

用微量热法研究了大肠杆菌HB101及其重组菌株的代谢特征．将不同大小的来源于嗜盐古生菌染色体DNA的启动子片段插入启动子探针载体中的氯霉素抗性基因前，获得重组菌株．结果表明重组菌株的半抑制浓度与DNA片段的启动功能大小是一致的，并且质粒的复制几乎不影响菌株的生长及代谢．培养基中加入氯霉素后，启动子启动氯霉素抗性基因表达，生长速率(k)降低，最大峰的出现时间(tp)延长，最大峰值(pm)也随之降低．在一定范围内，抗生素浓度与tp、pm呈线性关系．本研究结果直接证明了来自嗜盐古生菌的RM07、RM08和RM13片段在大肠杆菌中是有启动功能的，而且还表明基因表达量的高低与释放的代谢热变化相一致．因此微量热技术有可能为检测古生菌基因表达及其调控以及揭示古生菌这一特殊生命体的遗传和代谢特征提供一种新的灵敏的方法．     

小麦叶绿体DNA的提取与酶切

研究小麦叶绿体ＤＮＡ，需要快速，简便地获得质纯，量大的ｃｔＤＮＡ蒋高离子强度和抗坏血酸同时引入缓冲系统用于提取小麦ｃｔＤＮＡ利用高离子强度对ＤＮＡ与蛋白质之间的静电吸引造成襄胁损失的阻碍作用，及抗坏血酸提供低ｐＨ环境抑制酶活性等作用，得到较好的产率和纯度，并可得到清晰的限制性内酶图谱。     

pEGFP-MEK1/Q56P重组质粒的构建及融合基因在293T细胞中的表达

构建第56位氨基酸发生突变的MEK1基因(MEK1／Q56P)与增强绿色荧光蛋白(EGFP)报道基因融合表达的真核重组质粒pEGFP-MEK1／Q56P，经限制性酶切及测序鉴定后，将其导入293T细胞中，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，同时进行Western blot检测。酶切鉴定及测序结果表明构建的pEGFP-MEK1／Q56P与预期结果一致，荧光观察及Western blot结果表明MEK1／Q56P和EGFP在293T细胞中能以融合蛋白的形式表达，且MEK1／Q56P能特异性活化ERK1／2，本研究成功构建了含有MEK1／Q56P的绿色荧光蛋白真核表达质粒，便于对Raf／MEK1／ERK1／2信号传导通路做进一步研究。     

离子注入改良纤维分解细菌及其机理研究

对纤维分解细菌HY2进行不同剂量离子束注入诱变。通过研究离子注入对纤维素酶活性的影响。筛选出纤维素酶活性高的突变菌株HY2-3．通过聚合酶链式反应PCR技术扩增得到纤维素酶高产菌株Bacillus sp．HY2-3以及原始菌株Bacillus sp．HY2的纤维酶基因chy2-3和chy2．经过克隆和序列分析表明。所得到的突变型和野生型纤维素酶基因编码区均为1500bp．同时发现．经过离子束诱变得到的高产菌株和野生菌株的纤维素酶基因序列存在差别．这些碱基突变引起氨基酸序列的改变有可能导致两个菌株纤维素酶产量上的不同．