普通小麦过氧化物酶特异表达与基因定位

利用普通小麦CS+H″和CS+R″异源染色体双体附加系对过氧化物酶的特异表达和基因定位进行了研究,结果初步表明:不同的过氧化物酶间具有一定的表达频率和表达顺序的差别,并具有一定的发育时期和组织器官特异性,染色体互作在过氧化物酶的特异表达过程中具有重要的遗传调控功能,其中在CS+H″系统中,P_x-e4基因位于2H、3H和5H染色体上,P_x-d3和P_x-b8基因位于5H染色体上,P_x-a1和P_x-a2基因位于3H、4H、6H和7H染色体上,P_x-e2基因位于5H染色体上,P_x-a3基因位于4H染色体上,P_x-d2基因位于1H、2H和6H染色体上,P_x-b10基因位于2H、3H和7H染色体上,P_x-c7基因位于1H和7H染色体上,P_x-d1基因位于1H、2H,3H、4H、6H和7H染色体上。     

蚯蚓纤溶酶基因的cDNA克隆及其序列分析

从粉正蚓成体中提取总RNA，以寡核苷酸Oligo(dT)2v为引物合成cDNA第一条链；用RT-PCR的方法扩增蚯蚓纤溶酶的cDNA，将其克隆到pUCm-T载体上进行DNA序列测定．结果表明，所克隆的蚯蚓纤溶酶cDNA长度为747bp，其中编码区段为738bp．共编码246个氨基酸．将该序列与GenBank中其它的4种蚯蚓纤溶酶序列(Lumbricus rubellus EFE-III-1、Lumbricus rubellus lumbrokinase-3(1)precursor、Lumbricus bimastus lumbrokinase、Lumbricus rubellus lumbrokinase-1 T4 precursor)相比．同源性分别为99％，97％，89％，88％；与同源性最高的序列相比，本序列有7个碱基、3个氨基酸与该序列不同．     

血红蛋白模拟辣根过氧化物酶在酶联免疫分析中的应用

提出了以血红蛋白(Hb)作为辣根过氧化物酶模拟酶，用碳二亚胺法将其标记人IgG，Hb标记人IgG在形成免疫复合物后，仍可保持其95％的催化活性。以邻苯二胺作为氢供体，以羊抗人IgG为分析模型，建立了以血红蛋白作为酶标记物的竞争型免疫分析新体系。人lgG在15～1000μg／L范围内与体系吸光度呈良好的线性关系，线性方程为A=0．297-1．286E-4[IgG](μg／L)，相关系数r=0．9992(n=8)，检测限为15μg／L。用于人正常血清中人lgG含量的测定，加标回收率为94％～108％，结果令人满意。     

人nov基因全长cDNA克隆、测序及其组织表达谱分析

采用特异性mRNA富集技术，从人早期胚胎中得到人nov基因(novH)的cDNA克隆，序列分析表明，该基因cDNA序列由2389个碱基对组成，包含一段长1071bp的开放阅读框(ORF)，3′端含有加尾信号AATAAA和ply(A)尾巴。Northern杂交显示，在Hela细胞和肾上腺组织中有表达的novHmRNA，大小约为2．5kb；多组织RNA点杂交分析结果进一步表明，novH基因在肾上腺和主动脉中的表达水平相对较高，在成人肾、肝、肺和小肠组织中亦有少量的表达。     

半滑舌鳎DMRT 1基因的克隆与表达分析

利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的DMRT 1基因;并用RT-PCR技术检测了该基因在半滑舌鳎不同发育时期以及雌雄成鱼的不同组织的表达情况.结果表明,该基因cDNA序列全长1 232 bp(GenBank登录号为EU007655),包括774 bp开放阅读框,131 bp5′非翻译区以及含poly(A)信号的329 bp的3′非翻译区,编码258个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎DMRT1氨基酸序列与牙银汉鱼、黑鲷、青鳉、河豚和斑马鱼DMRT1氨基酸序列的同源性分别达到了63%、59%、54%、53%和52%;与光滑爪蟾、小鼠和人类的同源性较低分别为38%、42%和41%.RT-PCR分析表明,DMRT 1基因在半滑舌鳎早期胚胎不同发育时期和孵化后5、13、18、22和35 d的仔鱼均有表达,在孵化后22 d表达量最高.在成体鱼中只在雄性精巢中有特异表达,其他组织均无表达,表明该基因可能参与半滑舌鳎雄性性腺的发育或精子的形成.     

半滑舌鳎两种Aquaporinl同源基因的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AQP1o和AQP1基因的全长cDNA序列,并对其序列和表达模式进行了分析.结果表明,AQP1o cDNA全长为993 bp,包括120 bp的5'非翻译区,789 bp的开放阅读框,84bp的3'非翻译区,编码262个氨基酸的蛋白质,分子质量为28.3×103.AQP1的cDNA全长为1 335 bp,包括63bp的5'非翻译区,786 bp的开发阅读框,486 bp的3'非翻译区,编码261个氨基酸的蛋白质,分子质量为27.4×103.聚类分析表明半滑舌鳎AQP1o蛋白与金头鲷和塞内加尔鳎等海洋鱼类在卵巢中特异表达的AQP1o聚为一类,而AQP1与非卵巢特异表达的AQP1聚为一类,表明该两类基因为不同类型的AQP1同源基因.RT-PCR分析表明两个基因具有不同的表达模式,AQP1o主要在卵巢中表达,提示其在卵巢中具有特定的生理功能、而AQP1则在雌雄鱼的多种组织中表达.     

耐碱细菌NTT36耐碱基因的克隆及表达产物的分析

耐碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６总ＤＮＡ经ＥｃｏＲＩ酶不完全消化，与质粒ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ酶切产物在体外重组后，转化大肠杆菌ＨＢ１０１．在碱性平板上直接筛选耐碱转化子，转化子经检测具有氨苄青霉素（Ａｍｐｒ）抗性，分析表明转化子具有１５ｋｂ大小的重组质粒．用此重组质粒转化大肠杆菌ＨＢ１０１、ＤＨ５α和ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，均产生大量同时具有耐碱性和Ａｍｐ抗性的转化子．通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和点杂交证明此重组质粒（定名为ｐＧＣＡ）由ｐＵＣ１８和ＮＴＴ３６总ＤＮＡ的片段组成．分别提取上述３种克隆转化子和ＮＴＴ３６细胞膜蛋白，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ梯度凝胶电泳，发现在ｐＨ１０．６条件下培养的转化子和供体菌ＮＴＴ３６与在中性培养基中生长的转化子和受体菌相比，有５条多肽带有明显差异．表明这５条多肽带与耐碱性有关．     

四羧基锰酞菁作为超氧化物歧化酶和过氧化物酶模拟酶的研究

用核黄素 蛋氨酸光照法和黄嘌呤氧化酶 细胞色素C还原法证实,在1.0×10-6～1.0×10-5mol/L范围内四羧基锰酞菁(TcPcMn)表现出良好的清除超氧阴离子自由基(O—·2)的活性;用黄嘌呤氧化酶 NBT还原法测算出的TcPcMn清除O—·2的二级反应速率常数为7.77×105mol-1·L·s-1,表明TcPcMn作为超氧化物歧化酶(SOD)模拟酶能很好的抑制O—·2的还原性.TcPcMn既能催化H2O2与4 氨基安替比林和酚的显色反应,也能催化邻苯二胺的聚合,表明TcPcMn具有过氧化物酶(POD)活性.用邻苯三酚自氧法得出,TcPcMn将O—·2的氧化性转化成了POD和H2O2的氧化性.因此只要牺牲一定的POD底物,TcPcMn就可以清除掉因歧化O—·2而产生的H2O2,继而能避免因发生Fenton反应而产生氧化性高于O—·2的羟自由基,从而彻底消除O—·2的氧化性,与SOD相比,这是TcPcMn的一个优势.     

猪胃蛋白酶原A基因cDNA的克隆及其表达

根据GenBank中发表的猪胃蛋白酶原A（pepsinogen）基因序列设计引物，采用RTPCR技术，成功获得了猪胃蛋白酶原A基因，该基因全长1240bp，将该基因克隆到表达载体pPIC3．5K的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点构建重组表达质粒，通过电转化方法将重组质粒转化毕赤酵母GS115，检测结果表明猪胃蛋白酶原A基因在毕赤酵母中得到了表达．     

油菜叶绿体DNA在大肠杆菌中的克隆

用普通差速离心分离了甘蓝型油菜(Brassica napus)九二13系的叶绿体,并以苯酚、氯仿及RNase处理,纯化了叶绿体DNA.经BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ,SalⅠ与SmaⅠ五种限制酶酶解,电泳分析,估算出该环状叶绿体DNA分子周长约为140.5千碱基对(kbp),即分子量约92.7×10~6道尔顿(daltion).以质粒pBR325为载体,将叶绿体DNA的BamHⅠ酶解片段,引入大肠杆菌中克隆,得到了三个重组体.     

钝顶螺旋藻Fe-SOD基因的克隆及序列分析

参照GenBank中Fe-SOD基因序列,根据SOD的保守区域设计引物,以钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)基因组DNA为模板,PCR扩增获得大小为528 bp的片段.序列分析表明,其与集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803)、念珠藻(Nostoc commune DRH1)等物种的Fe-SOD基因的同源性分别为75%、71%,且由该序列推导的氨基酸序列与集胞藻、念珠藻等种属的Fe-SOD相比,同源性为68%、67%.表明该片段为钝顶螺旋藻Fe-SOD基因的部分序列.     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP70基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列。用半定量PCR方法研究了HSP70mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况。结果表明:HSP70cDNA全长为2 664bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1 917     

黄杆菌(Flavobacteriumsp.)ATCC27551 opd基因在E.coli中的克隆及表达

研究了黄杆菌 ATCC2 75 5 1的 opd基因在大肠杆菌中的表达 ,并对于表达产物进行了胞内定位和酶活测定 .通过 PCR扩增和 PCR产物直接克隆 ,将黄杆菌质粒上的一段长达 1137bp的 opd基因进行扩增及克隆 ,然后按正确的读码框亚克隆于表达载体 p ET2 8b( )上 ,转化宿主菌 E.coli BL 2 1(DE3) ,经 IPTG诱导 ,获得了较高量的基因表达产物 .该表达产物以包涵体的形式存在于细胞内 ,通过分离包涵体可以得到电泳较纯的条带 .工程菌的细胞活性达到原始菌株黄杆菌的水平     

三角褐指藻DGAT1基因生物信息学分析及表达调控研究

本研究采用转录组测序获得了三角褐指藻DGAT1基因cDNA全长序列(GeneBank登录号: 7200924), 并对其进行生物信息学分析和表达调控研究. 结果表明, 三角褐指藻DGAT1基因cDNA序列全长为1438bp, 开放阅读框(ORF)为1098bp, 编码365氨基酸序列, 含有脂肪酸蛋白特性(I)和DAG结合位点(II)等功能结构域. 预测三角褐指藻DGAT1蛋白为亲水性蛋白, 含有6个跨膜结构域和7个超强跨膜螺旋区, 无信号肽. 进化树分析表明, 三角褐指藻与海链藻DGAT1蛋白同源性最高. RT-qPCR结果表明, 光照强度和温度均显著促进三角褐指藻DGAT1基因的表达. 随着光照强度和温度的增加, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量呈先升高后降低趋势, 在光照强度为2500lx或温度为25℃时, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量达到最大, 这与三角褐指藻总脂含量的变化趋势一致, 同样揭示DGAT1蛋白与三角褐指藻总脂生物合成与积累密切相关.     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP7O基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列.用半定量PCR方法研究了HSP70 mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况.结果表明:HSP70cDNA全长为2664 bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1917 bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3 kD.HSP70基因不含内含子.氨基酸序列分析发现,推导的氨基酸序列含有HSP70家族的3个标签序列(I10 DLGTTYS17,V198 FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKV QK350).氨基酸序列同源性比较显示HSP70与紫贻贝(Mytihcs galloprovincialis)和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)氨基酸序列同源性分别为79.47％和77％.半定量PCR分析显示在正常褶纹冠蚌血液、外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺5种组织中均能检测到HSP70的基因表达.经过热休克或病原菌刺激后,蚌各组织中HSP70 mRNA的表达显著增加,其中热休克处理后,蚌的鳃和血液中HSP70 mRNA表达量增加最为显著;而嗜水气单胞菌刺激后蚌的肌肉和鳃组织中HSP70 mRNA表达量增加最明显.     

莲铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆和序列分析

用RT-PCR方法,从中国莲(Nelumbo nucifera)幼叶cDNA中成功扩增出铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)全长序列,并进行测序分析.该cDNA序列全长461 bp,包括起始密码子和终止密码子.其中编码区段为456 bp,共编码152个氨基酸,其编码蛋白的相对分子质量为1.552×104,等电点为4.515.与GenBank中其他物种的CuZnSOD进行同源性比较,发现其核苷酸序列相似性高达80%~86%,氨基酸序列相似性达89%~94%.所有已知的CuZnSOD的关键活性位点在该蛋白中均保守存在.将其与一些典型的单子叶和双子叶植物的该蛋白进行进化树分析,为富有争议的莲的系统学地位的确定,在分子生物学上为莲的系统学地位的确定提供了一个依据.该基因已在GenBank登记,序列号为DQ227345.     

扁穗冰草PLD基因cDNA序列克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR技术和RACE方法克隆得到扁穗冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn)PLD基因cDNA的全长,并对该cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、进化树、二级结构、三级结构、无序化特性进行了预测和分析.结果显示:扁穗冰草PLD基因具有2967个核苷酸,含有PLD所特有的HKD基序和C2结构域,属亲水性蛋白,二级结构以无规卷曲为主,蛋白质的三级结构显示两个HKD基序靠近形成具功能的活性位点,蛋白质无序化分析发现无序化区域较少;进化树分析表明与蒙古冰草亲缘关系最近,与草莓亲缘关系最远.为研究扁穗冰草PLD在干旱胁迫信号转导及应答过程的机理奠定基础.     

不同生境华东野核桃光合生理特性及叶绿素荧光参数比较

采用LI-6400便携式光合作用系统,于2011年7月下旬的晴朗天气条件下,对浙江省天台山林窗、林缘、林下生境华东野核桃（Juglans cathayensis var. formosana）的光合生理特性及叶绿素荧光参数进行测定,并比较林窗生境中华东野核桃与其伴生植物山胡椒（Lindera glauca）、玉兰（Magnolia denudata）、云锦杜鹃（Rhododendron fortunei）光合日进程的差异. 结果表明：夏季,林窗生境的华东野核桃及主要伴生植物叶片的净光合速率（P_n）日进程均呈“双峰”曲线,有明显的“午休”现象,其“午休”的原因主要是由非气孔限制因素引起的;林下、林缘的P_n日进程均呈“单峰”曲线.林窗生境的华东野核桃与林缘、林下相比,其光补偿点（LCP）低,光饱和点（LSP）高,对光适应的生态幅较宽;并且林窗生境的华东野核桃暗呼吸速率（R_d）低,日均P_n、最大净光合速率（A_max）高,有利于有机物的积累,说明林窗生境适合其生长. 3种生境华东野核桃的PSⅡ最大光化学效率（F_v / F_m）均呈现出“V”型曲线. 林窗生境中华东野核桃的日均P_n均比其他伴生植物高,且差异均极显著（P＜0.01）,说明华东野核桃的光合作用能力较强.