具有镇痛活性的芋螺毒素的研究进展

目前临床上使用的镇痛药物多具有成瘾性和耐受性等副作用,大大限制了其在临床上的应用,而芋螺毒素具有疗效好、不成瘾、副作用少等优点,因而具有潜在的开发价值和广阔的应用前景.目前已有多种芋螺毒素正被进行临床前及临床试验,其中用于治疗神经性疼痛的新药就达9种之多,本文介绍了具有镇痛活性的芋螺毒素的研究现状及其应用情况.     

脯氨酸羟基化促进芋螺毒素lt3a的氧化折叠

毒素lt3a是从信号芋螺毒管中分离鉴定到的一种天然多肽,天然来源的lt3a的第6位脯氨酸发生了羟基化修饰。为深入研究脯氨酸羟基化的生物学意义,以lt3a中第6位脯氨酸为研究目标,采用固相化学合成的方法分别合成了不含羟基化修饰的多肽lt3a和具有羟脯氨酸的多肽lt3a[P6O],并对其氧化折叠速率、热稳定性和功能进行了研究,发现在GSSG/GSH溶液中,lt3a[P6O]的氧化折叠速率是lt3a的两倍,但两者的折叠终产率相当,进一步实验表明羟脯氨酸的存在不影响lt3a的热稳定性和对神经干复合动作电位的作用。说明羟脯氨酸促进了lt3a的氧化折叠速率,但对其生物学活性没有显著影响。该研究一方面为芋螺多肽翻译后修饰研究奠定了基础,另一方面对芋螺毒素的结构改造提供理论依据。     

芋螺毒素国内外研究现状

芋螺毒素(conotoxins)是芋螺捕食与防御过程中的主要武器,是一类多数由10～40个氨基酸组成的活性多肽,具有分子量小、结构稳定、序列超变异、作用靶点广泛、功能专一等优点。现已发现的芋螺毒素七大超家族能特异性地作用于体内钾、钠、钙等多种离子通道、细胞膜上的各种神经递质和激肽的受体,从而干扰细胞或神经中的信号传递,有很强的生物学活性。既可以作为体内各种离子通道、受体类型及其亚型分类和鉴定的靶点探针,也可被设计作为药物的导向化合物或直接开发和筛选成为疗效特异的高效新药。本文总结了目前国内外芋螺毒素的研究现状。     

芋螺毒素（conotoxins）的研究进展

芋螺毒素是近年来研究得较多的一类海洋生物神经毒素,化学结构独特,是约含10－30个氨基酸残基的小肽,能特异地与神经受体结合。本文介绍有关芋螺毒素的发现,神经作用研究及分子生物学研究等方面的研究历史,及其在神经生物学和新药开发等方面的应用前景。     

芋螺毒素(conotoxins)的研究进展

芋螺毒素是近年来研究得较多的一类海洋生物神经毒素,化学结构独特,是约含10～30个氨基酸残基的小肽,能特异地与神经受体结合.本文介绍有关芋螺毒素的发现,神经作用研究及分子生物学研究等方面的研究历史,及其在神经生物学和新药开发等方面的应用前景.     

对于αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]安全性的评价

为了初步评价αO-芋螺毒素Ge XIVA[1,2]的安全性,以昆明种(KM)小鼠为受试动物,于给药组连续7天对每只小鼠肌肉注射10 nmol的αO-芋螺毒素Ge XIVA[1,2],对照组则给予等容积的生理盐水.实验期间监测小鼠的体重变化,观察小鼠的毒性反应,给药结束后,即第8天摘除其眼球并采血,检测小鼠的血常规、血液生化等指标,同时剖取其主要脏器,称重后计算脏器系数,并以此来评价Ge XIVA[1,2]的毒性作用,然后对该药物剂量的安全性进行初步评价.结果显示:Ge XIVA[1,2]组的小鼠与生理盐水组相比较,小鼠活动正常,且未见明显的毒性反应或死亡现象;实验期间给药组小鼠在各个观察时间的体重与对照组比较均未发现显著性差异(P0.05);给药组与阴性组在血常规检查、血生化检测、脏器系数(%)等方面均无显著性差异(P0.05).由此认为,在本实验剂量范围内,αO-芋螺毒素Ge XIVA[1,2]的安全性好,且无明显的毒副作用.     

F3重组毒素的克隆表达及纯化

以pEKH-F3质粒为模板,PCR扩增F3片段,将F3插入克隆质粒PQE80L,转化大肠杆菌,筛选,获得含有F3的PQE80L重组载体的克隆.提取绿脓杆菌菌株染色体DNA为模板,PCR扩增绿脓杆菌外毒素A催化区,PE40.然后将PQE80-F3和PE40重组,得到表达PQE80L-F3-PE40载体.转化至大肠杆菌DH5a,BL21,表达融合蛋白F3-PE40.结果显示,大肠杆菌表达了融合蛋白F3-PE40,表达的融合蛋白量大概占菌体总体蛋白量的20%.通过质粒提取、PCR扩增构建F3-PE40表达载体转化大肠杆菌,成功地表达了融合蛋白F3-PE40,为大规模表达、纯化F3-PE40的进一步功能奠定了基础.     

抗昆虫蝎毒素多肽的重组表达研究

蝎毒素是蝎子自我防御和捕食的有力工具,属于活性短肽。抗昆虫蝎毒素多肽作用于昆虫细胞膜离子通道,调控通道动力学特性,是潜在的生物杀虫剂,具很高的研究价值。序列比对分析发现,抗昆虫蝎毒素多肽有高保守性,序列同源性达67%,其中有4个保守的半胱氨酸残基,这可能与其抗昆虫作用的结构有关。但天然蝎毒素蛋白获取较困难,致使抗昆虫毒素多肽的结构与功能研究受限,因此,利用基因重组技术获得高纯度高活性重组蝎毒素是有效途径之一。本文综述了抗昆虫蝎毒素多肽外源重组表达的研究现状,旨在更深入全面理解其结构及抗昆虫机理等,以助推后续相关研究。     

抗痛蝎毒素多肽的重组表达研究

蝎毒素多肽作用于众多细胞膜离子通道,调控通道动力学特性。显具抗痛活性的蝎毒素多肽呈现较高的学术研究价值和医药应用前景。序列比对分析发现,抗痛蝎毒素多肽具较高保守型,序列同源性达45%,均具8个半胱氨酸残基,且其位置相对保守,这可能与抗痛功能有关。天然蝎毒素蛋白的获得、结构与功能研究受限,而高纯度、高活性重组毒素多肽是一条有效解决途径。本文综述抗痛蝎毒素多肽的重组表达,藉此推进其结构与功能相关性的理解。     

ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC对α9α10乙酰胆碱受体的活性研究

分析和检测了ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC对α9α10乙酰胆碱受体(nAChR)的结合活性,并用重组表达在非洲爪蟾卵母细胞膜上的大鼠α9α10 nAChR受体,分别评价了2个ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC在常规的ND96灌流液和不含钙离子的钡离子ND96灌流液(Ba2+ND96)中对该受体的阻断活性.研究表明,2个ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC在Ba2+ND96灌流液中对α9α10 nAChR没有抑制作用,而它们在常规的ND96灌流液中却表现出微弱的抑制活性,这应是受钙离子激活产生的氯离子电流影响的结果.因此,2个ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC并不是α9α10 nAChR的有效阻断剂,其作用机理与α-芋螺毒素Vc1.1和Rg IA完全不同.本研究阐明了芋螺毒素抑制α9α10 nAChR和钙离子通道的机理,这对研发新型的芋螺毒素镇痛药和更好地治疗顽固性疼痛具有很重要的科学意义.     

重组海葵毒素AP-b毕赤酵母表达体系的建立及其鉴定

按照毕氏酵母的偏爱密码子,设计并合成了海葵毒素AP-b的基因序列,将合成基因序列通过一系列操作导入毕氏酵母表达载体pPICZa中,以电穿孔方法转化毕氏酵母菌株X33,通过PCR法鉴定,筛选出能够表达重组海葵毒素的酵母菌株.结果表明,构建出海葵毒素AP-B毕赤酵母真核表达体系,并鉴定出4株含有海葵毒素基因的毕赤酵母工程菌.     

D型产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的表达与纯化

复苏实验室保存的产气荚膜梭菌ε-pET28a(DE3)菌株,经限制性内切酶EcoRⅠ,XhoⅠ双酶切鉴定后,诱导表达得到大量可溶性的ε重组毒素蛋白.对重组蛋白进行镍柱纯化,得到纯度高于95%的毒素蛋白,利用Western Blot和ELISA分析检测纯化后的毒素蛋白,显示该蛋白具有良好的特异性和免疫原性,为进一步研究单链抗体做铺垫.     

花生AhNCED1重组蛋白原核表达分析

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是调控ABA生物合成的关键限速酶.根据花生叶片中克隆得到基因AhNCED1,构建融合蛋白重组表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中诱导表达,SDS-PAGE分析显示在0.2mmol/L IPTG、4h、28℃的条件,目的蛋白以可溶形式高效表达,相对分子质量在66kD左右. AhNCED1重组蛋白可与制备抗体特异性结合,呈现典型的不规则卷曲结构.     

反义c—myc重组逆转录病毒的制备及浓缩保存

将人ｃ－ｍｙｃ基因中从部分第一内含子到第二外显子和它３旁侧第二内含子的前８个核苷酸共１．５３ｋｂ片段，反向克隆于逆转录病毒离体ｐＤＯＲｎｅｏ中，构建了重组逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ＢＤ９，在Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导了将其导入包装细胞ＰＡ３１７，经过两轮亚克隆筛选，获得了单克隆，病毒滴度为１０＾６ＣＦＵ／ｍＬ的重组病毒分泌细胞株ｐＡＣ－ＢＤ９，它能稳定，高效地分泌含有目地基因片段的重组逆转录病毒颗粒ｐ     

重组人神经生长因子昆虫表达载体的构建及表达

目的:构建重组人神经生长因子(rh-NGF)杆状病毒表达载体,转染昆虫细胞从而获得目的蛋白的大量表达.方法:从人胎盘组织中提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增-NGF基因片段,经BamHI、HindⅢ双酶切后插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTM-Dual+[rh-NGF].对构建的载体进行PCR和酶切鉴定并测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA对rh-NGF的表达进行检测.结果:构建的rh-NGF基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA检测结果显示病毒感染的Sf9细胞可表达rh-NGF.结论:成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[rh-NGF],并在昆虫细胞系Sf9中得到表达,为大量制备重组人神经生长因子奠定了基础.     

DAB389-Linker-LHRH重组毒素的构建及生物活性的初步测定

采用基因工程方法,将白喉毒素的毒性部分(DAB389)通过柔性连接肽(Linker)与促黄体激素释放素(LHRH)基因连接起来,克隆到高效表达载体pET28a( )中,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白(DAB389-Linker-LHRH).通过三步层析纯化目的蛋白,获得了纯度达95%的重组毒素DAB389-Linker-LHRH.用MTT法检测其对过度表达LHRH受体的人宫颈癌HeLa细胞的毒性作用,探讨其对HeLa细胞的特异杀伤情况.实验结果显示DAB389-Linker-LHRH对HeLa细胞具有很强的生长抑制作用,其IC50为12.93μg/mL.表明该免疫重组毒素在体外对人宫颈癌HeLa细胞具有明显的杀伤作用,为进一步研制对宫颈癌有特异治疗作用的靶向抗癌药物奠定了基础.     

新型冠状病毒复制依赖基因MTHFD1的表达及功能

【目的】研究新型冠状病毒(SARS CoV 2)复制依赖基因MTHFD1在人群间的功能差异以及该基因与病毒蛋白的相互作用关系。【方法】使用千人基因组计划和gnomAD数据库,系统分析MTHFD1基因的重要功能变异(包括有害错义变异和eQTL变异)在世界不同人群间的分布。并进一步通过蛋白互作数据库STRING和IntAct,以及手工文献检索,寻找与MTHFD1蛋白有相互作用的其他蛋白。【结果】MTHFD1基因上有419个错义突变,其中有害变异195个;大部分的有害变异都是低频的,唯一的例外是变异位点rs10813,它在全世界总人群中等位基因频率大于001且该位点在物种间具有保守性。此外,在肺组织中发现了1个MTHFD1基因的eQTL变异(rs57087457),该位点在东亚人群中具有更低的等位基因频率,说明在东亚人群中MTHFD1基因可能具有较高表达水平。通过蛋白相互作用研究,发现GGH,ACSL3,MAT2B,ARF6,CUL2,BRD4等6个蛋白与MTHFD1蛋白存在蛋白互作。【结论】在不同人群中,MTHFD1存在天然抗性变异,这些变异的等位基因频率在人群间存在差异,可能对新型冠状病毒的易感性和感染后症状有影响;蛋白互作研究结果则提示MTHFD1基因在新型冠状病毒感染细胞中发挥了多种功能。     

重组人白细胞介素6工程菌的表达和功能初探

自人外周血的mRNA中获得了白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6)cDNA,基因被克隆并在大肠杆菌中表达,在20L发酵罐中每L发酵液可得60g湿菌体,IL-6的表达量约占大肠杆菌全蛋白的30%以上,占包含体蛋白的60%。纯化产物在长期,急性毒性和三致实验正常的基础上,用恒河猴的功能实验表明,在不制造血象降低模型的情况下,仍能明显增加血液中血小板和白细胞的数量。     

重组艰难梭状芽孢杆菌毒素TcdB对人体肠上皮细胞层功能的影响

利用Transwell小室体外建立人结肠细胞T84上皮细胞层,分析不同质量浓度重组艰难梭状芽孢杆菌毒素TcdB(1 000、100、10ng/mL)对上皮细胞层跨膜电阻(TER)的影响;通过免疫荧光染色分析TcdB对上皮细胞层结构的影响;运用荧光标记葡聚糖作为指示剂,检测毒素作用后上皮细胞层的旁通路渗透情况;通过细胞毒性分析,检测上皮细胞层功能受损情况下,TcdB的跨膜渗透。结果发现:重组艰难梭状芽孢杆菌毒素TcdB能引起剂量依赖性单层上皮组织跨膜电阻降低和渗透性增加,在24h内质量浓度为1 000、100、10ng/mL的TcdB能导致上皮细胞层分别丧失100%、70%、50%电阻力,同时分别引起30%、20%、10%的葡聚糖渗透;上皮细胞层受损后,大分子毒素通过旁通路的非正常跨膜渗透也增加。共聚焦分析显示上皮细胞层的细胞间紧密连接结构受损。综上所述,艰难梭状芽孢杆菌毒素TcdB介导的体外培养人T84肠上皮细胞层功能损伤主要表现为电生理学功能异常,旁通路渗透性增加,细胞间紧密连接结构破坏。     

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。