H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶的表达及抗体制备

以禽流感病毒A／chicken／Hubei／489／2004（H5N1）NA基因全长eDNA克隆pMD-NA为模板，PCR扩增第406位至第1353位基因片段。克隆到pET-28a表达载体，构建重组质粒pET-28／ANA，转化大肠杆菌，用异丙基口硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE和Western blot分析证实，截短的NA重组蛋白获得高效表达。采用SDS-PAGE纯化重组蛋白，免疫家兔，制备特异性神经氨酸酶（NA）抗体。ELISA及间接免疫荧光检测结果显示，该抗体效价在1：1×10^5以上，能与在大肠杆菌和Vero细胞中表达的NA蛋白产生特异性反应。纯化的NA重组蛋白可用作建立禽流感检测方法的诊断抗原，所制备NA抗体可用于检测禽流感基因工程疫苗中的NA抗原组分。     

SARS-CoV S蛋白的原核表达及其粘膜免疫效应

SARS冠状病毒（SARS-CoV）的S（Spike）蛋白是病毒表面最主要的膜蛋白，在病毒的感染过程中起重要作用，是冠状病毒的主要抗原．以SARS冠状病毒的cDNA为模板，通过PCR得到S△1（151～1200bp）、S△2（1201～2250bp）和S△3（2251～3150bp）3段基因序列，克隆到表达载体pET-32a，在大肠杆菌BL21中诱导表达得到包涵体蛋白，经Western blot检测正确后，将此作为抗原以滴鼻和腹腔注射两种小同的途径免疫BALB／c雌性小鼠，3次免疫之后采集小鼠的血清和肺洗液，经酶联免疫吸附实验（enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA）检测其中的抗体IgG和IgA．结果表明S蛋白通过滴鼻途径既能刺激产生一定的血清IgG，更能诱导肺粘膜产生特异IgA抗体．进一步比较分析发现，诱导粘膜免疫的效应区域主要位于S△2（401～750aa）蛋白区段．     

池蝶蚌金属硫蛋白基因的原核表达及活性分析

筛选池蝶蚌性腺转录组并运用RT-PCR方法扩增池蝶蚌金属硫蛋白(metallothionein,MT)ORF框序列。该序列有216个碱基组成,编码71个氨基酸,其中半胱氨酸含量丰富,富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys结构。多序列比对表明,池蝶蚌MT蛋白序列和其他物种MT序列有很高的同源性,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)MT蛋白具有100%的同源性。将该ORF框片段导入原核表达载体pET-32a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为27kDa,在25℃,终浓度为1mM IPTG诱导4h表达量最高,重组蛋白主要存在上清液中,纯化并获得了重组蛋白。细胞增殖实验表明,纯化的MT融合蛋白有生物活性并能有效地减轻宫颈癌Hela细胞的氧化胁迫效应。     

梅毒螺旋体重组融合蛋白的表达及免疫特性

表达纯化梅毒螺旋体重组融合蛋白,研究其抗原性和免疫原性,为梅毒诊断试剂和疫苗研究提供新候选抗原。合成梅毒螺旋体重组融合蛋白Tp0453-TpF1-Tp0965基因,转入大肠杆菌中进行表达;镍柱纯化重组融合蛋白,western blot鉴定;以重组融合蛋白作为抗原,酶联免疫法(ELISA)检测人血清样本,分析其抗原性;利用该重组融合蛋白免疫新西兰兔,ELISA检测兔血清抗体滴度水平,评价其免疫原性。梅毒重组融合蛋白Tp0453-TpF1-Tp0965在工程菌中成功表达,分子量为50kD。重组融合蛋白可被梅毒抗体阳性的血清识别,梅毒阴性血清与蛋白无反应。使用重组融合蛋白作为抗原检测人血清梅毒抗体,梅毒患者样本组与非梅毒患者样本组的检测结果存在非常显著性差异。重组融合蛋白免疫兔后,兔血清中可持续检测到高滴度梅毒抗体。梅毒重组融合蛋白Tp0453-TpF1-Tp0965有良好的抗原性和免疫原性,可作为梅毒诊断试剂抗原和梅毒疫苗的候选蛋白。     

基于生物信号纳米放大技术的戊肝病毒检测基因芯片

建立了一种利用“双探针夹心银染”技术快速检测戊型肝炎病毒（HEV）的基因芯片方法。提取的病毒核酸经过RT-PCR扩增，PCR体系中用掺人生物素修饰的dUTP扩增得到带有生物素的核酸片段，5’末端-NH。修饰的同源寡核苷酸作为捕获探针固定到处理后的玻片上，该探针识别病毒的带有生物素的核酸片段，而链霉亲和素标记的胶体金与生物素紧密结合，通过银沉积在金颗粒表面放大信号可以目视结果。采用该方法对已经确证的86个血清样本进行检测，检出52个阳性和34个阴性样本，结果与荧光定量PCR检出一致。     

人丙型肝炎病毒核心抗原基因的表达和纯化

人丙型肝炎病毒Ｉ型（ＨＣＶ－Ｉ）核心抗原编码区ｃＤＮＡ，全长５７３ｂｐ，编码１９１个氨基酸，被克隆到一种新的表达质粒ｐＲＳＥＴＨｉｓＢ中，转化大肠菌ＢＬ２１菌株，在１ｍｍｏｌＬ－１ＩＰＴＧ诱导３７℃培养５ｈ，核心抗原表达水平达到高峰，表达出分子量２６×１０３的融合蛋白，并在细胞内形成微小晶体．表达水平达到细胞总蛋白的４０％左右，通过纯化，获得的核心抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检查为均一分子量２６×１０３的蛋白，用酶联免疫法进行血清学初步检查，纯化的核心抗原与ＨＣＶ阳性血清显示出强烈的阳性反应，对慢性丙肝病人血清中抗ＨＣＶ抗体的阳性检出率达９３％，而与正常人血清则无阳性反应     

一株H5N1亚型禽流感毒的分离鉴定与基因组序列分析

对一株于2005年从浙江省分离获得的禽流感病毒株（A／Chicken／zhejiang／24／2005）进行了鉴定、全基因组序列测定、分析和致病性研究．经血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验证实，此分离病毒株为H5NI亚型．对该毒株的全基因组序列测定和分析显示，HA蛋白在HA1和HA2连接处，含有连续多碱性氨基酸模体（-RRKKR-）．进化分析结果表明，A／Chicken／zhejiang／24／2005（H5N1）7个基因来源于2004～2005年湖南地区流行株，但PB1基因来源于未知野禽毒株．动物实验结果显示，Ck／ZJ／24／05对鸡和鸭均具有高致病性，对小鼠无致病性，与HA的序列特征相符合．     

利用模拟代谢活化体系研究污染物的基因毒性

利用二氯乙烷、三氯乙烷、三氯乙烯、N，N二甲基甲酰胺、内酮作为典型污染物与Fe^2＋/EDTA／H2O2／联氨模拟体系反应，所产生的活性中间体与4-（对硝基苄基）吡啶反应生成了紫红色物质，据此，本文建立了一种分光光度法检测活性中间产物的新方法，该办法测量灵敏度高（10mol／L），应用该方法证实了其中4种污染物（二氯乙烷、三氯乙烷、三氯乙烯、N，N-二甲基甲酰胺）具有形成DNA加合物的能力．同时对代谢活化体系的各种显色条什进行了优化。     

呼吸道合胞病毒感染SPC-A1相关新基因zlg10con的电子克隆及分析和验证

通过mRNA差异显示法获得了与呼吸道合胞病毒感染SPC-A1细胞相关的52个表达序列标签(EST)片段，其中的一个EST片段g10-1在RSV感染后的细胞中高表达．采用生物信息学原理和方法对g10-1进行了鉴定后预测这是一个新基因片段，经电子克隆获得了761bp的延伸产物，并且通过了实验验证．该基因片段含有一个典型的54个氨基酸的ORF，命名为zlg10con，并对该序列进行了蛋白结构和功能的分析．     

离子色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测尿样中的三价铬和六价铬

用离子色谱和电感耦合等离子体质谱联用法同时测定样品中三价铬和六价铬．经ICS-AG14A（Dionex，USA）阴离子色谱拄分离，60mmol／L HNO3淋洗液淋洗，用等离子体质谱仪（m／z 50，52和53）在线测定了Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ），并对影响测定的各种因素进行了研究．该方法可以在2min内分离并测定Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）．Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）的检出限（S／N=3，m／z 53）分别为0．05μg／L和0．5μg／L．线性范围（m／z 53）从0．5μg／L到500μg／L跨越4个数量级．R.S．D．（n=6，m／z 52）优于2％，本方法应用于尿样中的Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）测定，结果较为满意．     

水稻高温、干旱响应基因OsHdr5的克隆与表达谱分析

低温、高温、干旱等非生物逆境通常会严重影响到水稻的生长及产量.为深入了解水稻逆境反应的分子机理和挖掘耐逆相关基因,本文采用Affymetrix水稻表达芯片对水稻多逆境下的全基因组表达谱进行分析,并筛选出众多表达特异基因.OsHdr5是其中一个在多个生长发育时期与组织器官中受高温、干旱诱导均显著上调的基因,用实时定量PCR方法(real-time PCR)对其表达水平进一步分析,两组结果基本吻合.用PCR方法扩增获得长为743bp的全长基因序列,其ORF区编码167个氨基酸残基,组成的肽链含有磷酸化激酶位点,形成的二级结构包含一个由6个α螺旋和2个β折叠组成的跨膜结构域,进一步分析推测其可能是叶绿体膜上与细胞跨膜信号传递相关的功能蛋白.     

钝顶螺旋藻Fe-SOD基因的克隆及序列分析

参照GenBank中Fe-SOD基因序列,根据SOD的保守区域设计引物,以钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)基因组DNA为模板,PCR扩增获得大小为528 bp的片段.序列分析表明,其与集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803)、念珠藻(Nostoc commune DRH1)等物种的Fe-SOD基因的同源性分别为75%、71%,且由该序列推导的氨基酸序列与集胞藻、念珠藻等种属的Fe-SOD相比,同源性为68%、67%.表明该片段为钝顶螺旋藻Fe-SOD基因的部分序列.     

墨胸胡蜂毒腺基因cDNA文库的构建及鉴定

从墨胸胡蜂毒腺中提取总RNA，经Oligo(dT)磁珠纯化mRNA后，用AMV反转录酶合成第一链cDNA．完成第二链cDNA合成后，过柱纯化50bp以上的片段，与载体pUC118连接，转化E．coli JM109，建立了cDNA文库．得到的780个阳性克隆中，重组率达到98．5％．大部分插入片段在500～900bp．随机挑选10个短序列测序，一个为蜂毒激肽基因序列．     

大黄鱼gdf-8Ⅱ开放阅读框序列克隆及分析

GDF-8是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子,对gdf-8的研究将有助于促进重要养殖鱼类大黄鱼的遗传育种．在已克隆大黄鱼gaf-8Ⅰ的基础上,采用同源克隆策略,首次克隆了2357bp的大黄鱼gdf-8Ⅱ开放阅读框序列（ORF）,它由3个外显子、2个内含子组成,编码359个氨基酸,其中外显子Ⅲ与大黄鱼gdf-8Ⅰ的外显子Ⅲ序列相似度较高,这提示外显子Ⅲ受到了高度的进化限制及其功能的重要性．基于gdf-8推导的氨基酸序列构建的系统树显示鱼类的gdf-8Ⅱ是与gdf-8Ⅰ不同的基因,有必要对gdf-8Ⅱ基因进行进一步的研究．     

草鱼CCL4基因的克隆及表达

草鱼CCL4基因全长854 bp,最大开放阅读框位于104~397 bp,编码97个氨基酸,其中32~73氨基酸为其保守的CC趋化因子家族结构域,N-端有1个由24个氨基酸组成的信号肽。草鱼CCL4与斑马鱼的同源性为69%,与其他鱼类和哺乳类的同源性在50%以下。系统进化分析也显示其与斑马鱼CCL4基因的亲     

香菇135和9015品种遗传多样性的RAPD分子标记研究

通过抗逆性较差的香菇135品种和自然变异抗性新菌株庆元9015品种的RAPD研究,寻找两者间有差异的基因,并对其进行克隆和测序.GenBank查询结果表明,这些片段可能的部分开放阅读框（ORF）与多种生物的水解酶或者信息素受体的部分氨基酸序列有较高的同源性. 这些片段可以作为两者间的特异分子标记.     

草鱼IFI58基因的鉴定及其表达分析

草鱼IFI58全长cDNA为1764 bp,其中ORF为1440 bp,编码1个479 aa的蛋白。草鱼IFI58包含有10个TPR 34肽结构域,并与哺乳类IFIT相对应。其中,TPR7被中间插入序列分为TPR7A和B,TPR4也有5个氨基酸插入,TPR3只有B部分而缺少A部分。鱼类IFI基因与哺乳类的同源性不高,系统进化树也显示它     

中国红豆杉细胞紫杉醇合成期特异表达新基因TS1-FL的部分cDNA克隆

采用mRNA差异显示技术(DDRT—PCR)比较了悬浮培养的中国红豆杉细胞合成紫杉醇前后的基因表达差异,并从紫杉醇合成期细胞中分离出一个特异表达的cDNA克隆TS1．TS1长度为638bp,序列相似性分析结果表明它代表一新基因序列(Genbank登录号：AF426429),将此新基因命名为TS1-FL．开放读框分析结果表明Tsl拥有一个不完整的开放读框,蛋白质同源性检索没有发现与TS1翻译序列有较大同源性的蛋白质．对此基因的进一步研究可揭示它在紫杉醇生物合成中所扮演的角色．     

人类新基因MATH2的克隆及其功能初步分析

通过测序和采用生物信息学分析方法 ,从人胎脑 c DNA文库内得到了一条长 2 .175 kb的 c DNA序列 ,其开放读框编码含 337个氨基酸的蛋白 .推论该蛋白与鼠 MATH2蛋白有 98%的同源性 ,故将新基因定名为人 MATH 2基因 .推论该基因定位于人染色体 7p14- 15 .Northern杂交结果显示该基因只在人脑内特异表达 ,在1.7kb和 2 .4kb处出现特异性条带 .人 MATH2蛋白可能与鼠 MATH2蛋白具有相似的功能 .