凡纳滨对虾兰尼定受体基因亚克隆文库的构建及部分序列的测定

将一个含有凡纳滨对虾兰尼定受体基因的fosmid克隆用DNA剪切仪进行片段化处理,回收3～5kb之间的DNA片段连接到pUC118HincⅡ/BAP载体上,构建了适合于鸟枪法测序的亚克隆文库.经鉴定,该文库滴度为5.0×104 cfu.mL-1,重组率达到90%,插入片段大小在3～5kb范围内.随机挑取100个阳性克隆进行两端测序,通过拼接得到一条兰尼定受体基因部分片段,该片段长2 550bp.通过比对分析,发现该基因片段推导的氨基酸序列与果蝇兰尼定受体基因有较高的相似性.     

凡纳滨对虾组织蛋白酶L基因的单核苷酸多态性分析

采用PCR产物直接测序法,对凡纳滨对虾40份DNA样本的组织蛋白酶L基因进行单核苷酸多态性(SNP)检测.经过对测序结果统计分析,共发现SNP 20个,分别是:A150C,T226G,G240A,C429T,T453C,G537A,C597T,C645T,G798C,C831T,C955T,C963T,C977T,C982T,G1001C,A1005T,C1117T,C1132T,G1367A,T1391C.其中6个SNP是外显子中的错义突变,3个SNP是外显子中的同义突变,11个SNP是内含子中的突变.本检测为进一步进行凡纳滨对虾生长性状关联研究提供了有用信息.     

凡纳滨对虾生长性状的微卫星DNA标记分析

利用TUMXLv6．124、TUMXLv8．32、TUMXLv9．145、TUMXLv6．63和TUMXLv7．121c等5个微卫星标记分别对2个凡纳滨对虾群体的基因组DNA进行检测，用SSPS软件分析标记基因型和凡纳滨对虾体重之间的关系．分析结果表明，微卫星位点TUMXLv6．124和凡纳滨对虾的体重显著相关．在该位点中，基因型TUMXLv6．124-AA的个体的体重均值显著高于基因型TUMXLv6．124-AB和TUMXLv6．124-BB．其他4个微卫星标记和凡纳滨对虾的体重关系不显著．     

凡纳滨对虾养殖池塘水温预测模型研究

通过对凡纳滨对虾养殖大棚内外池塘水温与气温的同步监测分析,利用统计方法研究了池塘温度变化特征及水温预测模型.结果表明:与气温相比,池塘水温日振幅较小,日最高温度出现时间滞后;晴天条件下水温与气温的日变化大于阴天;由于增氧设备的使用,池塘上下层水温温差较小,滞后不明显;与棚外池塘水温相比,大棚池塘水温变化平缓,受外界天气条件影响较小,日平均水温比棚外高出9.47℃,且能维持在30~33℃,为最适宜对虾生长的水温.利用水温与气温的相关关系及水温滞后效应分别建立了大棚内、大棚外池塘日最高和最低水温自回归模型,经Durbin-h检验及广义差分法消除自相关,对部分回归模型进行了修正,各模型的回归效果达到了显著水平,平均相对误差均在5.0%以内.经验证各模型预测精度较高,具有较好的可靠性和普适性,可用于池塘水温的预报.     

凡纳滨对虾亲环素A基因的克隆及表达分析

通过电子克隆所得基因序列设计引物,采用RT-PCR方法首次克隆得到长度为885 bp的凡纳滨对虾亲环素A（Cyclophilins A）CYPA基因cDNA序列,其开放阅读框为35~529 bp,可编码164个氨基酸.推算其分子量约为17.6×103,理论等电点为8.55.与其他物种的CYPA基因比对发现,该基因的氨基酸序列具有较高的保守性.基于氨基酸序列的聚类分析表明,凡纳滨对虾与斑节对虾的亲缘关系最近.荧光定量PCR的结果显示该基因在组织中广谱表达,在抗病组中,胃中的表达量最高,心脏中的表达量最低,差异约为2倍.而在感病组中,该基因在心脏中的表达量最高,肌肉中的表达量最低.利用ProtFun在线预测蛋白质的功能分类,表明CYPA基因可能是一免疫应答抑制因子,参与凡纳滨对虾免疫防御反应.     

凡纳滨对虾设施化养殖塘中浮游植物的动态变化

2012年3月20日~8月24日, 对宁波地区凡纳滨对虾设施化养殖塘水体中的浮游植物进行调查分析. 结果表明: 养殖塘中共鉴定出浮游植物6门24种. 其中硅藻门15种, 占藻类种类数的62.5%; 蓝藻门3种, 占13%; 绿藻门3种, 占13%; 黄藻门、金藻门、甲藻门各1种. 养殖早期浮游植物藻密度1.019×105 cell?mL-1, 生物量0.17mg?mL-1, 多样性指数为0.926; 养殖后期浮游植物藻密度1.301×105 cell?mL-1, 生物量0.44mg?mL-1, 多样性指数为1.547. 浮游植物数量变化总体表现为养殖前期低、后期高的特征.     

呋喃唑酮在凡纳滨对虾组织中代谢动力学研究

运用液相色谱-串联质谱法研究了呋喃唑酮药饵多次给药后在凡纳滨对虾体内的药物代谢动力学.研究结果表明：呋喃唑酮代谢物在血淋巴、肝胰脏、肌肉组织中的代谢过程均符合二室模型,其动力学方程分别为C血液=414.107×e^-0.092t＋124.451×e^-0.005t,C肝胰腺=1625.563×e^-0.019t＋125.700,C肌肉=120.434×e^-0.019t＋71.579×e^-0.001t.凡纳滨对虾血淋巴和肝胰腺中呋喃唑酮代谢物浓度在4h达到高峰,肌肉中药物浓度在2h达到最大值;最高峰时血淋巴、肝胰腺和肌肉中药物浓度平均为570.6μg·L^-1、1948.6μg·kg-1和210.0μg·kg-1.在血淋巴、肝胰腺和肌肉组织中呋喃唑酮代谢物浓度的吸收半衰期（t1/2α）分别为7.497h、36.206h和36.484h,消除半衰期（t1/2β）分别为132.525 h、1 000 479.217 h和505.637 h,总表观分布容积（V1/F）分别为55.775 L·kg^-1、17.16 L·kg^-1和161.574L·kg^-1.说明给药后呋喃唑酮代谢物在凡纳滨对虾体内消除缓慢,残留严重,尤其以肝胰脏残留最为明显.     

海链藻定向培养对凡纳滨对虾生长、存活及养殖水质的影响

旨在探究定向培藻在凡纳滨对虾养殖中应用效果. 选取体长0.545cm的凡纳滨对虾84万尾, 随机分为2组(每组3个重复, 每个室内水泥池(30m2)14万尾), 对照组水体不添加藻, 试验组水体中添加海链藻(藻浓度维持2×104~5×104 cell?mL-1), 试验周期25d. 结果表明: 定向培藻对凡纳滨对虾生长、存活及养殖水质影响显著(P＜0.05), 其中, 对虾体长、体质量成活率和饵料系数均为海链藻组显著大于对照组(P＜0.05); 养殖水体的pH日差值和、NO3--N、NH4+-N、PO43--P和养殖水体中弧菌数量均为海链藻组显著小于对照组(P＜0.05). 由此可见, 在凡纳滨对虾养殖过程中, 养殖池中添加定向培海链藻有利于维持养殖池水体的水质稳定, 减少水体的氮磷含量和抑制弧菌的生长, 同时也有利于凡纳滨对虾的健康生长.     

输入碳氮比对凡纳滨对虾生长和养殖水体水质的影响

调节碳氮比改善水质和促进对虾生长已有一些报道, 但不同实验室得出的结论经常相互矛盾. 本研究通过建立规范一致的对虾养殖实验体系, 设置对照组(CN6组, 碳氮比为6)和处理组(CN10组和CN20组, 碳氮比分别为10和20), 每组设置8个重复, 研究输入碳氮比对凡纳滨对虾生长和养殖水体水质的影响. 结果表明, 适当提高输入碳氮比可促进对虾生长和存活. 与对照组相比, CN10组的末均重、虾长、特定生长率、存活率和产量分别提高了18.04%、7.45%、13.11%、46.73%和73.03%, 而饲料转化率降低了43.41%. 此外, CN10组的水体理化指标如pH、溶解氧、氨氮、亚硝氮、磷酸盐、总磷的浓度也极显著低于CN6组. 相关性分析表明影响对虾生长的主要环境因子是亚硝氮、磷酸盐、总磷和pH. 然而, 实验第25d, CN20组对虾大量死亡, 产量和存活率都很低, CN20和CN10组的对虾体重和体长均高于CN6组, 说明过高的输入碳氮比可以促进对虾生长但不利于对虾存活. 本研究说明重复数对于实验结论的可靠性有较大影响.     

浙江省患病凡纳对虾副溶血弧菌的分离、鉴定及毒力基因分析

对浙江省发病凡纳对虾进行了弧菌分离、鉴定, 对分离菌株进行了API-20E生化鉴定, 不耐热毒素基因tlh、致病基因tdh、trh和毒力基因pir的PCR检测, 以及高致病性副溶血弧菌对小鼠致病性研究结果显示, 150个分离菌株中共检出tlh基因菌株61株(40.67%), ap阳性菌株21株(14.00%); 189个固定样品中检出副溶血弧菌阳性样品108个(57.14%), ap阳性样品24个(12.70%); 所有tlh阳性样品中均未检出tdh、trh毒力基因; ap阳性副溶血弧菌灌胃小鼠死亡率为20%, 且其培养上清液有弱溶血效价. 表明副溶血弧菌在浙江省凡纳对虾弧菌感染中占有重要地位, 高致病性副溶血弧菌在副溶血弧菌中占较高比例, ap阳性副溶血弧菌对小鼠具有一定毒力和溶血性.     

磁珠快速核酸提取法在南美白对虾病原检测中的应用及其性能评价

为实现南美白对虾相关病原核酸快速、便捷提取,并实现原材料国产化,降低成本,建立了一种基于国产磁珠的核酸快速提取方法(以下简称磁珠法).以携带虾肝肠胞虫的南美白对虾为实验样本,通过微流控芯片对3种磁珠提取的核酸进行测试,并对裂解液中盐酸胍浓度及洗涤液2中乙醇浓度进行了优化.通过优选实验确定:奥润磁珠提取效果优于其他两种磁珠;裂解液中盐酸胍的最佳浓度为4 mol·L^-1;洗涤液2中乙醇的最佳质量分数为75%.在此基础上,分析评价了优化后的磁珠法核酸提取线性范围、灵敏度、精密度、特异性及抗干扰能力等技术性能.结果显示:稀释10⁴倍后的低浓度病原核酸仍保持较好的扩增效果,变异系数为2.03%,表明建立的磁珠法具有较宽的检测范围,灵敏度高,特异性和抗干扰能力强.本文建立的磁珠法可实现快捷、通用、高纯度、低成本的南美白对虾主要病原的核酸提取.     

3种滩涂贝类对凡纳滨对虾养殖尾水净化效果的比较研究

以文蛤、缢蛏和泥蚶3种滩涂贝类为研究对象, 评估了3种滩涂贝类不同处理模式下的尾水处理效果. 在流水模式下比较不同贝类及密度对水质指标影响的结果表明 所有实验组均显著降低了水体总悬浮物; 泥蚶对氨氮和亚硝酸盐去除效果较好, 文蛤对弧菌有良好的去除效果. 静水模式下的结果表明 滩涂贝类对尾水处理效果与流水模式趋势相似, 静水模式下高密度(?m-2)贝类更能有效净化水质, 而适当降低贝类密度(?m-2)有利于去除养殖尾水中的弧菌总数. 静水模式下对水体菌群研究结果表明 高密度(?m-2)文蛤组和高密度(?m-2)缢蛏组水体菌群Chao1、可观测物种指数升高, 泥蚶组菌群丰度和多样性方面更趋于稳定.     

表达猪瘟病毒E2基因和gfp报道基因的伪狂犬病病毒双基因转移载体的构建

将以PRVgG为启动子，SV40plyA为加尾信号的CSFV E2表达盒克隆于包含伪狂犬病病毒（PRV）tk基因和gH基因片段的重组质粒pTK2.5,替换掉tk基因的SalⅠ与XhoⅠ酶切位点之间的序列，构建了携带CSF E2基因的转移载体pTKE2。免疫荧光检测证实，转染BHK21细胞pTKE2在感染PRV的情况下，能表达E2蛋白，采用特异性引物PCR方法扩增gfp表达盒，对酶切位点进行改造，将其克隆到pTKE2的SalⅠ位点，构建了利用PRV gG启动子和HCMV IE启动子分别控制E2基因和gfp基因表达，两基因取向相反的双基因转移载体pTKE2.EFP.将双基因转移载体pTKE2.GFP转染BHK21细胞中，12h后在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的GFP表达，表达的GFP不引起细胞毒性。     

rbcL基因在水稻叶绿体DNA基因库克隆中的定位

由水稻品系珍汕９７不育系为材料制得的叶绿体ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）基因库中，筛选到屯含核酮糖１，５－二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基基因（ｒｂｃＬ）的重组质粒，对该重组质粒用ＰｖｕⅡ，Ｐｓｔ１ｔ和ＳａｌＩ限制性内切酶进行了分析并制得了限制图谱，ｒｂｃＬ基因在该图谱上进行了定位。