转基因花卉的DNA提取与多重PCR分析

分别以CTAB法、DNA提取试剂盒提取菊花、矮牵牛、非洲菊3种花卉的基因组DNA，凝胶电泳结果表明试剂盒提取的效果较好。设计合成了3对引物，分别扩增花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因（nos）终止子、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(nptⅡ）基因。普通PCR检测结果表明，3种花卉6个样品中仅矮牵牛的1个样品含有这3种转基因成分，酶切鉴定结果验证了PCR产物为非假阳性。尝试以多重PCR同时检测转基因矮牵牛与对照阳性质粒中的2个或3个转基因成分，得到预期结果。     

植物性转基因食品的检测与验证方法

根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列，设计并合成了两对不同的引物，建立了PCR-酶切分析-Southern杂交检测并确认转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法．并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测，发现13份样品中有6份检出35S启动子和NOS终止子，7份样品结果为阴性．结果表明建立的检测与验证方法能有效检出转基因作物及其食品中的35S启动子和NOS终止子，具有灵敏度高、特异性好和结果准确的特点，可应用于进出境产品的转基因成分检测．     

实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测中的应用研究进展

随着转基因食品的快速发展,转基因食品的大规模商业化引起了对安全性问题的广泛争议.为了对转基因食品作出综合的评价,建立灵敏、快速、准确、高通量的检测方法十分必要.本文综述了实时荧光定量PCR技术的基本原理、优缺点及其在转基因食品检测中的应用与研究进展,并探讨了该技术存在的问题和应用前景.     

大豆样品中DNA的提取与外源基因CaMV35S的PCR检测

采用试剂盒从大豆样品中成功提取出DNA,对花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了电泳检测,建立了提取大豆DNA与CaMV35S启动子PCR检测的方法,对实验操作中的问题进行了探讨.     

人GABRA1实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

根据GenBank上人GABRA1基因的序列,设计并合成特异性的引物及探针,采用TaqMan探针法建立了荧光定量PCR法,以常规PCR产物为标准品,建立标准曲线．结果表明,标准曲线Ct值检测范围为12．07-32．72,相关系数为0．999,扩增效率为96．4%.建立的GABRA1TaqMan探针实时荧光定量方法具有线性范围广、扩增效率高、检测时间短、敏感性高等特点．     

猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中编码猫杯状病毒（FCV）衣壳蛋白ORF2的保守序列, 设计并合成了一对引物和相应的TaqMan探针, 建立了快速检测FCV的荧光定量PCR
方法. 通过对该方法的反应体系和反应条件进行优化, 建立了标准曲线, 给出了特异性、 敏感性和重复性实验, 并对临床24份疑似样品（其中阳性3份、 阴性21份）进行检测.  结果表明: 该方法检测cDNA的线性关系为0.992, 线性范围为2.26×10¹¹~2.26×10¹拷贝/μL; 可检测出样品中的FCV, 其他猫相关病毒检测为阴性; 批内重复性实验变异系数为2.158%， 与病毒分离结果相符.     

烟叶中曲霉菌含量的荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为快速准确地对仓储烟叶中的曲霉菌含量进行测定,通过对几种曲霉菌的ITS区基因序列比对找出曲霉菌属遗传保守序列,以此为靶序列设计特异性引物及Taqman探针,构建烟曲霉基因序列重组质粒为阳性标准品,并绘制标准曲线,建立了烟叶中曲霉菌含量荧光定量PCR检测方法并验证该方法具有较好的特异性、灵敏度及重复性.利用此方法对模拟霉变烟叶进行跟踪检测,结果表明：当烟叶中曲霉菌基因拷贝数在10⁹～10¹¹copies·g^-1之间时,烟叶处于临近霉变的状态;大于10¹¹copies·g^-1时烟叶为霉变状态;小于10⁹copies·g^-1时烟叶则为未霉变状态.该研究以期为仓储烟叶的霉变情况监控提供了一种更为高效灵敏的检测方法.     

食品中单增李氏菌实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

运用实时荧光PCR(Real-time PCR)技术建立了对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法，设计的引物和探针的序列特异性强，省去凝胶电泳的繁琐，降低了污染的可能性，在对26种病原菌进行检测过程中，运用实时荧光PCR法和经典培养法进行比较，结果表明用实时荧光PCR法检测单核细胞增多李斯特氏菌，更快速、敏感、特异性更高。     

兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重PCR检测方法的建立

目的 建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法 本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法优化引物浓度,构建kmt1、nuc和kh1基因的重组质粒标准品pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp,确定最小检测量;以兔源支气管败血波氏杆菌和产气荚膜梭菌等9种病原体核酸样本确定多重PCR法的特异性;通过批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。结果 最适退火温度为54.5℃;扩增kmt1和nuc基因的引物最适浓度均为1μL(10μmol/L),扩增kh1基因的引物最适浓度为0.5μL(10μmol/L);pMD-Pm最低检测限为20.6 copies/μL,pMD-Sa最低检测限为18.2 copies/μL,pMD-Kp最低检测限为23.2 copies/μL,表明其灵敏性高;该方法仅对Pm、Sa和Kp有特异性扩增条带,对其他病原体均无扩增条带,表明特异性较强;...     

“水产品致病菌多重荧光PCR检测方法的建立与应用研究”项目介绍

汕头出入境检验检疫局检验检疫技术中心系经国家出入境检验检疫局（现为国家质量监督检验检疫总局）批准，于1999年12月成立，并于2002年4月经国家事业单位登记管理局批准注册的独立法人单位。中心下设8个实验室。其中食品检测、动物检疫、玩具检测、化矿金属检测、纺织品检测、工业品检测等6个实验室获得中国合格评定国家认可委员会（CNAS）的认可和国家级资质认定（计量认证）。食品检测实验室还是全国具备对欧盟出具茶叶农残检测证书的22个实验室之一。粤东玩具检测中心是全国首批15家玩具强制性产品认证（CCC认证）的指定检测机构之一。本中心为汕头乃至粤东口岸出入境检验检疫的行政执法提供技术支撑，负责出入境商品的实验室检验检测及鉴定工作。同时，接受社会委托的检验鉴定业务。此外，还承担有关检验检疫的应用技术研究、技术开发、技术咨询和检验检疫标准的制修订工作。     

霍乱弧菌及副溶血弧菌复合PCR检测方法的建立

根据已发表的副溶血弧菌和霍乱弧菌的基因组序列,设计合成了三对引物,用于同时检测这两种弧菌。扩增片段长度分别为285 bp、450 bp、643 bp。经实验验证建立的PCR检测方法特异性较好,三对引物间无互相干扰;同时对建立的PCR检测体系进行了敏感性测定,结果最低检测下限为2.1×103cfu/mL。     

TaqMan MGB实时荧光PCR对转基因大豆定量检测的研究

 利用实时荧光定量PCR技术,根据转基因大豆（Roundup Ready^TM）的外源基因35S启动子序列设计引物和TaqMan MGB探针,对大豆粉中Roundup Ready^TM大豆含量进行了定量检测,根据这个检测体系建立了35S启动子Ct值与样品中转基因成分数量之间的标准曲线和线性回归方程(相关系数r²: 0.9942)。本研究设计的方法还可以应用到多组分的食品、饲料等加工产品,检测转基因成分的含量,并可作为转基因食品常规PCR定性检测方法。     

RT-qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因 转录水平方法的建立

目的 建立实时荧光定量(RT-qPCR)检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)基因转录水平的方法,以在转录水平上对XDH/XO基因进行定量检测。方法 提取Wistar大鼠肝脏组织中总RNA,经逆转录得到cDNA, 以10倍为稀释因子稀释为5个浓度梯度,使用设计的引物序列和内参基因进行RT-qPCR检测,得到XDH/XO基因表达的标准曲线。进而检测Wistar大鼠高尿酸血症动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结果 RT-qPCR法检测得到的XDH/XO基因标准曲线溶解峰单一,R2接近1,能检测出高尿酸动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结论 RT-qPCR检测Wistar大鼠XDH/XO基因转录水平的方法具有定量准确,重复性好的特点,可应用于高尿酸血症的发病机理、新药研究等方面。     

多重RT-PCR方法对人肺炎链球菌菌种、血清型及耐药性的鉴别检测

首先,选择肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)基因LytA、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)基因P1、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,CP)基因ompA作为目标检测靶点设计引物探针,建立鉴别肺炎链球菌菌种的多重RT-PCR方法.其次,针对肺炎链球菌cps基因座序列,利用MGB-TaqMan探针的多重RT-PCR方法对肺炎链球菌的血清型进行鉴别检测.最后,针对肺炎链球菌耐药基因ermB、mefA为靶标设计引物探针,采用多重RT-PCR方法对其临床阳性样本的耐药性进行鉴别检测.肺炎链球菌鉴别检测多重RT-PCR方法,线性范围为102~107 copies/mL,R2分别为0.999、0.996和0.995,灵敏度可达102copies/mL,与其他病原体无交叉反应.512例临床样本经多重RT-PCR方法鉴别检测,肺炎链球菌189例(189/304,62.17%),肺炎支原体83例(83/304,27.30%),肺炎衣原体32例(32/304,10.53%),与单重FQ-PCR及基因测序法比较无统计学差异(P0.05).189例肺炎链球菌临床样本,经多重RT-PCR检测,血清分型为:19(19.58%,37/189)、23(15.87%,30/189)、6(13.23%,25/189)、14(6.3%,12/189),其他血清型(22.75%,43/189),其他血清型(22.22%,42/189).肺炎链球菌抗药菌株突变检测为:ermB突变115例(115/189,60.85%),mefA突变56例(56/189,29.63%),两基因共突变15例(15/189,7.94%).     

转基因大豆和玉米加工产品的双重精确定量PCR检测方法

在很多国家,转基因生物(GMOs)及其衍生产品必须标有精确的转基因含量.最近研究中,实时定量PCR技术广泛应用于转基因成分的检测.然而,转基因生物的实时定量PCR方法的精确度仍然是一个难以解决的问题,尤其是对于高温处理过的样品.为了更好地准确定量高温处理样品中转基因的含量,对普通的实时定量PCR体系做了一些改进,包括重新设计内源基因和外源基因的引物,使得扩增较短并且大小接近的目标DNA片段,同时引物的GC含量和溶解温度也都相近.此外,采用热处理加工模型(HTPM)的方法,制备了含有转基因大豆GTS 40-3-2的样品,并验证了改进后的实时定量PCR系统.实验结果表明:使用改进后的实时定量PCR体系测定热处理过的样品,发现其中的转基因含量的定量偏差明显降低.同时使用改进的双重实时定量PCR进一步验证转基因大豆的加工食品,结果也显示,转基因含量的定量结果更准确.这些结果表明:改进的双重实时定量PCR将适用于热加工产品的定量检测.     

中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR方法的建立和优化

根据GenBank中卤虫actin基因的保守区域序列设计井合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ作为染料建立了实时荧光定量PCR（real—time fluorescence quanfitative PCR）方法．以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,其相关系数达到了0．999．溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰,Tm为83.6℃,结果表明：本实验建立的中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR法扩增效率高、特异性强、线性范围广、检测周期短,为actin基因作为内参基因进行卤虫早期胚胎发育基因表达的定量分析奠定了基础．     

同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109～104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。