双链特异性核酸酶介导的高灵敏度microRNA分析

基于氧化石墨烯(GO)对荧光标记单链DNA探针的荧光猝灭效应以及双链特异性核酸酶(DSN)选择性切割DNA/RNA杂合结构中DNA单链的特性,本文建立了一种新型恒温信号放大方法用于microRNA(miRNA)的高灵敏度检测.靶标miRNA首先与荧光DNA探针杂交,DSN能够特异性地将杂合双链中的DNA探针水解为碎片但不会降解miRNA,GO对酶切产生的寡核苷酸碎片吸附能力显著降低,使得荧光基团远离GO表面而不被猝灭.释放出的miRNA可再次发生与荧光DNA探针杂交、DSN酶切等反应,如此反复,可实现恒温条件下一个miRNA分子与多个探针杂交、酶切、释放荧光基团的循环过程,最终体系的荧光信号得到显著放大,通过记录体系的荧光信号即可实现对靶标miRNA的灵敏检测.     

基于核酸外切酶Ⅲ信号放大技术的荧光适配体传感器用于卡那霉素的检测

建立了一种基于核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)和碳纳米颗粒(CNPs)的信号放大体系用于卡那霉素(KAN)检测的新方法。合成了水溶性的CNPs,并设计合成了不同序列的DNA,具体包括:卡那霉素适配体(Apt),羧基荧光素标记的信号DNA探针(FAM-DNA)和互补链cDNA。当体系中不存在KAN时,Apt与cDNA可以杂交形成双链DNA,体系中FAM-DNA处于单链状态,Exo Ⅲ不能水解单链DNA;此时,体系中加入CNPs,单链FAM-DNA被CNPs吸附,荧光发生淬灭;在KAN存在下,Apt与其靶标KAN特异性结合,此时FAM-DNA与cDNA杂交形成双链DNA,由于CNPs对双链DNA吸附较弱,DNA探针的荧光不发生淬灭。ExoⅢ可以特异性的从3’-端对FAM-DNA降解,释放FAM荧光团和cDNA,该体系通过"降解-杂交"循环,最终释放出大量的FAM荧光团。由于CNPs对FAM具有较低的亲和力,释放出的FAM不能吸附在CNPs表面,FAM荧光不会发生淬灭,实现荧光信号放大扩增作用。方法线性范围为50～100 nmol/L,检测限为2.5 nmol/L。该方法可用于实际样品牛奶中卡那霉素的检测。     

双链特异性核酸酶的生物学和医学应用

双链特异性核酸酶DSN是一种能高选择性地识别并酶切完全匹配的DNA双链或者DNA-RNA杂交双链中的DNA,而对单链DNA和RNA几乎没有作用的核酸酶.DSN酶的上述特点使其在生物和医学等领域广泛应用,主要包括全长cDNA文库的均一化、单核苷酸多态性(SNP)检测和高通量测序等.近年来,DSN酶在microRNAs(miRNAs)的检测领域得以长足发展和应用.miRNAs是一组内源性、非编码短序列RNAs,在生理和病理过程中具有重要作用,但由于其序列短、丰度低等特点, miRNAs的检测一直是临床难题.新近研究主要基于DSN酶信号放大的特点,相继建立了一系列生物传感技术,通过采用不同检测原理如比色法、荧光法、电化学法等实现痕量miRNAs检测.本文就DSN酶在miRNAs检测、SNP检测、全长cDNA文库均一化及高通量测序等方面的生物学应用进行了综述.     

基于DNA双链取代策略免标记检测铅离子的研究

建立了一种基于DNA双链取代策略和SYBR GreenⅠ(SG)作为荧光染料插入剂进行免标记铅离子检测的荧光传感方法。SG作为一种染料分子,与单链DNA作用产生的荧光强度很弱,但可以插入双链DNA,使SG荧光强度明显增强。检测时铅离子适配体首先与其部分互补单链DNA杂交形成稳定的双链DNA结构,当溶液中存在铅离子时,铅离子与其适配体特异性结合,双链DNA的数量减少,加入SG可实现铅离子的免标记定量检测。此方法具有灵敏度高、特异性强、简便快速等优点。最低检测浓度为2 nmol/L,检出限(S/N=3)为1.6 nmol/L,实际样品检测结果良好。     

基于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大DNA检测

设计合成了一种长臂发夹型核酸探针,结合核酸外切酶Ⅲ水解反应建立了一种免标记荧光信号放大高灵敏检测DNA的新方法.当不存在靶DNA时,SYBR GreenⅠ荧光染料能够嵌入发夹型探针的茎部而发出很强的荧光,而当存在靶DNA并与发夹型探针杂交后,核酸外切酶Ⅲ从杂交产物的3'端开始水解发夹型探针,释放出靶DNA,并触发下一个酶水解反应,同时SYBR GreenⅠ染料也随发夹型探针水解而释放,导致荧光信号降低,从而实现了对DNA的免标记荧光信号放大高灵敏检测.该方法的检出限低至320 fmol/L,比传统双标的分子信标的方法降低了4~5个数量级,且该方法还具有免标记、简单、快速的特点.     

基于胸腺嘧啶-三聚氰胺-胸腺嘧啶结构和SYBR GreenⅠ荧光检测牛奶中三聚氰胺

基于胸腺嘧啶(T)-三聚氰胺-T特异性结构,建立了SYBR GreenⅠ荧光均相检测三聚氰胺的方法。三聚氰胺不存在时,SYBR GreenⅠ与聚T单链DNA结合较弱,荧光信号较弱;三聚氰胺存在时,聚T单链DNA通过T-三聚氰胺-T错配形成折叠结构。SYBR GreenⅠ嵌入双链DNA的双螺旋结构中,释放出强荧光信号。结果表明,三聚氰胺浓度在0.1~10μmol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为35 nmol/L。本方法简单、快速、成本低、灵敏度高。     

基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的荧光法检测四环素

以核酸适配体作为识别单元、核酸外切酶Ⅲ(EXO Ⅲ)作为信号放大元件以及氧化石墨烯(GO)作为信号开关的荧光传感器来检测四环素(TC)。当体系中没有TC存在时,四环素适配体与其互补链(c DNA)杂交形成双链,EXO Ⅲ不能切割5'端标记有荧光基团的单链信号链(SP),加入GO后,信号链被吸附至GO表面并发生荧光淬灭。当体系中有TC存在时,核酸适配体能够识别并且结合TC,促使c DNA与SP链形成双链,这将诱导EXO Ⅲ从信号链3'端对c DNA-SP双链进行切割,释放出荧光基团,游离的荧光基团不能被GO吸附而淬灭,通过连续的酶促切割,得到更多的游离荧光基团,从而使得荧光信号明显增强。建立的荧光法对TC具有较高选择性,检测限(LOD)为671 pmol/L,方法已用于自来水样品中TC的测定。     

基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅(Ⅱ)

利用核酸切割酶(Nicking endonuclease)识别特定DNA双链并切割其中某条单链的性质,构建了基于8-17E脱氧核酶(8-17E DNAzyme)的pb2+荧光循环放大检测方法.pb2+可激活8-17E脱氧核酶水解RNA底物,产生并释放出的单链与分子信标探针( Molecular beacon,MB)杂交,导致其茎环结构被破坏,荧光信号恢复;同时形成含有核酸切割酶Nt.BbvCI识别位点的双链区域.在核酸切割酶Nt.BbvCI的作用下,分子信标探针被切割释放,游离出来的单链可与其它分子信标重新杂交,从而触发下一轮酶切,引起荧光检测信号的循环放大.本方法避免了8-17E脱氧核酶与底物链的修饰,最低可以检测出水溶液中1.0×10-10 mol/L Pb2+,并在2倍浓度的Zn2+,以及5倍浓度的其它干扰金属离子存在的情况下对pb2+显示出良好的选择性.本方法对环境水样中pb2+的标准加样回收率为96.1％～108.0％.     

杂交及切断过程的QCM实时检测研究(英文)

采用自组装技术,将 5′端标记有巯基的 20-merODN(oligo 1)以金 硫键形式牢固结合在 7. 995MHz的AT-切石英晶体的镀金表面,然后由石英晶体微天平实时检测了与碱基序列互补的 10 merODN (oligo 2)和 8 merODN(oligo 3)的杂交,同时还研究了稀土金属铈离子在温和条件下对DNA的水解切断作用.结果表明:应用QCM方法可能实时检测DNA的固定和杂交,Ce(IV)能随机切断单链DNA;但不能切断杂交形成的双链DNA,因此可利用杂交保护的方法对单链DNA实行定位切断.     

基于聚多巴胺纳米粒子的荧光共振能量转移法检测microRNA

基于聚多巴胺纳米粒子(PDA NPs)对Cy5标记单链DNA(Cy5-ssDNA)探针的荧光猝灭效应以及脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)选择性切割DNA/RNA杂合结构中单链DNA的特性,建立了一种用于微小核糖核酸(miRNA)检测的新型恒温信号放大方法.在优化的实验条件下,体系的相对荧光强度(FR)与miR-21浓度的对数值成正比;对miR-21检测的线性范围为10 pmol/L~100 nmol/L,检出限达7 pmol/L.血清加标实验结果表明,该方法可用于生理环境下miR-21的检测.     

双链特异性核酸切割酶等温循环扩增结合 高效液相色谱高灵敏检测双目标microRNA

通过双链特异性核酸切割酶(DSN)循环扩增策略结合高效液相色谱(HPLC)法,实现了对两种疾病标志物microRNA(miRNA)的选择性分离和高灵敏检测.采用酶循环等温扩增策略增强了目标miRNA的信号,提高了HPLC法检测核酸的灵敏度.利用固定在磁珠上的不同长度和碱基序列的DNA探针实现了不同miRNA信号的色谱分...     

水溶性碳纳米粒子的制备及其在DNA和单核苷酸多态性分析中的应用

利用电化学氧化的方法制备了水溶性好、粒径为7～12nm的碳纳米粒子,该碳纳米粒子通过π-π相互作用吸附荧光标记的单链DNA探针,并能有效地猝灭其荧光．当单链DNA探针与匹配的DNA目标分子杂交形成双链DNA时,猝灭的荧光被恢复,由此可以检测1-200nmol／L的DNA目标分子。此外,在碳纳米粒子存在时,由荧光标记的DNA探针和DNA目标分子形成的双链DNA的熔解温度可以简便地被测定,当双链DNA有错配碱基时,其熔解温度降低,由此可方便、快速地分析单核苷酸多态性．     

磁珠表面核酸探针的固定及电化学方法检测

报道了用戊二醛将氨基修饰的寡核苷酸探针固定于氨基磁珠表面制成核酸传感器，传感器与生物素标记的DNA杂交，再利用亲和素－生物素偶合系统，偶联上亲和素标记的碱性磷酸酶。碱性磷酸酶催化底物α-萘酚磷酸酯（α－NATP）水解形成具有电化学活性的α-萘酚，用示差脉冲伏安法测定杂交结果，本法测得短链DNA片断的浓度线性范围为10－1000μg/L；最低检测限为3μg/L。作者优化了相关的检测条件，并成功测定了乙型肝炎病毒HBV－DNA的片段。     

基于切刻内切酶信号放大的电致化学发光DNA生物传感器的研究

利用切刻内切酶的酶切作用实现信号放大,结合量子点高效的电化学发光性能,构建了一种新型电化学发光DNA生物传感器.将捕获探针DNA(c-DNA)通过自组装的方式固定到金电极表面,后与目标DNA(t-DNA)互补杂交形成双链DNA,利用切刻内切酶Nt.BstNBI特异性识别双链上的酶切位点(5'-GAGTC-3'),然后在c-DNA相应的切割位点(识别序列3'端后的4个碱基处)对其进行剪切,释放出目标链,参与下一轮的杂交及酶切,通过目标物的循环利用,实现信号放大.利用N-羟基琥珀酰亚胺(N HS)和1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)活化羧基化CdTe量子点表面的羧基,与电极表面残留的c-DNA末端的氨基共价交联,通过测定捕获的量子点的电化学发光信号对目标DNA进行检测.优化后的检测条件为:c-DNA浓度1 μmol/L,杂交时间60 min,Nt.BstNBI浓度0.5 U/μL,酶切反应时间4h.在优化条件下,目标DNA浓度在2.0×10-13～2.0×10-11 mol/L范围内,其对数与电化学发光强度呈线性关系,检出限为7.3×10-14 mol/L.人体血样加标回收率为96.4％～108.0％.     

基于CdS标记的信号放大DNA电化学检测方法

利用CdS纳米粒子为标记物,提出了一种基于目标循环利用进行信号放大的电化学方法,实现对特定序列DNA的超灵敏检测.利用磁珠固定连接DNA进而连接硫化镉纳米粒子.连接DNA与目标DNA杂交之后,由于切刻内切酶对双链DNA中的连接DNA进行切割,并使目标DNA释放后循环利用,从而大量的CdS纳米粒子从磁珠表面释放.结合磁珠的高分离性能和溶出伏安法的高灵敏性,实现目标DNA的快速、高灵敏检测,其检测的线性范围为0.4fM～100fM,检测限为0.08fM.此外,该检测方法具有高的选择性、稳定性和重现性.通过设计不同的内切酶和特定的DNA序列,有望用于其他DNA的高灵敏检测.     

检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的DNA传感器研制

利用共价键合法,将氨基修饰的具有急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因特异性的单链DNA探针固定在玻碳电极表面,构成急性早幼粒细胞白血病DNA传感器 (急粒DNA传感器).以电活性的芦荟大黄素(AE)为杂交指示剂,考察了杂交温度及传感器的特异性、重现性和检出限等性能.结果表明:AE在裸电极上的吸附常数为(4.5±0.2)×105 L·5mol-1,与单链DNA修饰的玻碳电极(ssDNA/GCE)和双链DNA修饰的玻碳电极(dsDNA/GCE)结合常数分别为(2.1±0.4)×105和(2.7±0.2)×105 L·5mol-1.这种新型的DNA传感器具有特异性强、灵敏度高和重现性好的优点.应用此方法于临床血清分析,初步探索了将该法应用于临床检测的可行性.     

基于银纳米粒子构建荧光传感平台用于核酸检测

报道了基于银纳米粒子构建的荧光传感平台,并用于核酸检测.此荧光传感平台对核酸检测基于以下策略:首先,荧光团标记的单链DNA探针被吸附到银纳米粒子的表面,荧光团与银纳米粒子近距离接触,发生荧光猝灭;加入与探针DNA序列互补的目标DNA,两者杂交形成双链DNA,并从银纳米粒子的表面脱离,荧光得到恢复.这种银纳米粒子构建的荧...     

基于碳量子点-银纳米簇荧光共振能量转移纳米探针的荧光传感器检测转基因成分CaMV35S

利用荧光共振能量转移(FRET)纳米探针结合催化发夹组装(CHA)无酶扩增信号放大途径建立了一种可用于转基因成分的荧光检测方法。首先为CaMV35S目标序列(tDNA)设计了可诱导的CHA循环的两个发夹结构序列HP1和HP2。当单链DNA标记碳点(sDNA-CDs)和DNA模板化银纳米团簇(Ts-AgNCs)杂交后,AgNCs和碳量子点(CDs)靠近,形成FRET效应,得到sDNA-CDs/Ts-AgNCs荧光猝灭的比率荧光探针。当tDNA存在时,通过杂交反应打开HP1发夹,形成HP1-tDNA双链结构;该结构可将HP2的发夹结构打开,从而形成HP1-HP2双链结构,同时释放出tDNA进入下一轮杂交,触发CHA循环。由于HP1-HP2中HP1的部分序列与Ts部分序列间的亲和性较sDNA强,因此,加入sDNA-CDs/Ts-AgNCs后,sDNA-CDs从探针中释放,使CDs(λ_em=464 nm)的荧光得以增强。而AgNCs仍在双链结构中,其荧光强度(λ_em=560 nm)基本保持不变。以I_F464/I_F560...     

采用电活性标记物N-(2-乙基-二茂铁)马来酰亚胺检测与表面固定的 一致性双链DNA特异性作用的p53蛋白质

建立了电化学检测表面固定捕获的野生型p53蛋白质的方法. 首先在金电极表面形成巯基化的单链DNA探针/己硫醇(HT)混合自组装膜, 随后巯基化的单链DNA探针与溶液中序列匹配的靶点DNA杂交, 所形成的一致性双链DNA捕获溶液中的野生型p53蛋白质. p53分子表面的半胱氨酸残基采用巯基特异性试剂N-(2-乙基-二茂铁)马来酰亚胺(Fc-Mi)进行衍生. 通过检测二茂铁的电化学信号来指示p53与一致性双链DNA之间的特异性相互作用. p53蛋白质与双链DNA的键合程度取决于双链DNA的序列. 该方法可检测的p53最低浓度为1.33 nmol•L－1.     

聚胸腺嘧啶单链DNA-CuNCs荧光增强法用于汞离子的高灵敏检测

基于Hg~(2+)与DNA中胸腺嘧啶(T)结合的高度特异性和DNA铜纳米簇的荧光增强性质,构建了一种简便、灵敏检测汞离子的新方法.当Hg~(2+)存在时,聚T单链DNA(P1)通过T-Hg~(2+)-T特异性结合形成双链DNA,Cu~(2+)经抗坏血酸钠还原后生成的中间体Cu+与双链DNA螺旋结构间的氢键部分有强的结合力,促使Cu0附着聚集在双链DNA上形成铜纳米簇,导致体系荧光增强,从而实现对汞离子的高灵敏检测.体系荧光强度与Hg~(2+)浓度的对数值成正比,对Hg~(2+)检测的线性范围为1.0 nmol/L~10μmol/L,检出限达0.4 nmol/L,对湖水样品中Hg~(2+)检测的回收率达到97.2%~106.6%.与传统方法相比,该方法具有无需标记、检出限低及选择性好等优点,可用于环境水体中汞离子的测定.