鲇鱼和斜带石斑鱼核糖体蛋白L15完整cDNA的克隆和序列分析

通过RT—PCR和3′RACE方法,分别从鲇鱼(Sitlurus asotus)和斜带石斑鱼(Epine phelus coioides)中克隆了核糖体大亚基蛋白L15(ribosomal protein L15,RPL15)的完整cDNA,并详细分析了其序列特征．这两种鱼的RPL15蛋白cDNA均包含一个615个核苷酸的完整阅读框,推测分别编码一个204个氨基酸的蛋白．不论是核苷酸序列还是推测的氨基酸序列,这2个序列分别与同属的南方大口鲇和同科的大眼鳜rpl15序列同源性最高,与其他已知的脊椎动物rpl15序列也有较高的同源性．基于这2个序列的编码区和其他鱼类的rpl15编码序列进行分子系统学分析,与传统的形态分类结果是一致的．     

莲铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆和序列分析

用RT-PCR方法,从中国莲(Nelumbo nucifera)幼叶cDNA中成功扩增出铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)全长序列,并进行测序分析.该cDNA序列全长461 bp,包括起始密码子和终止密码子.其中编码区段为456 bp,共编码152个氨基酸,其编码蛋白的相对分子质量为1.552×104,等电点为4.515.与GenBank中其他物种的CuZnSOD进行同源性比较,发现其核苷酸序列相似性高达80%~86%,氨基酸序列相似性达89%~94%.所有已知的CuZnSOD的关键活性位点在该蛋白中均保守存在.将其与一些典型的单子叶和双子叶植物的该蛋白进行进化树分析,为富有争议的莲的系统学地位的确定,在分子生物学上为莲的系统学地位的确定提供了一个依据.该基因已在GenBank登记,序列号为DQ227345.     

黄鳝DEAD-box家族PL10基因的克隆与序列分析

通过PCR克隆的方法，从黄鳝(Monopterus albus)中得到两个PL10基因的cDNA片段Mo PL10A和Mo PL10B，长度均为1．127kb，推测其编码375个氨基酸的蛋白片段．结合其他PL10类同源物序列，对这两条cDNA进行了分析和初步的功能推测．根据此片段的氨基酸序列构建的系统发育树与形态分类结果一致．在不同组织中的RT—PCR结果表明Mo PL10A和Mo PL10B的mRNA在各组织中的分布有差异．     

基于线粒体co I 基因探讨无尾目10个科的分子系统关系

运用PCR技术和相关生物软件，对大头蛙Limnonectes kuhlii和脆皮大头蛙Limnonectes fragilis的线粒体coⅠ基因全序列进行了测定与分析．结合GenBank上已公布的无尾目10个科22个物种的同源序列，以爬行纲楔齿蜥Sphenodon punctatus和密河鳄Alligator mississippiensis为外群，基于核苷酸序列（选取前两位密码子）和氨基酸序列两种数据形式，分别构建NJ树和MP树．结果表明：系统树将无尾目10个科分为两大支，一支为新蛙亚目Neobatrachia的5科15个物种，一支为古蛙亚目Archaeobatrachia的5个科9个物种（其中包括锄足蟾科Pelobatidae和负子蟾科Pipidae），并推测这两个亚目均为单系群．古蛙亚目一支内的盘舌蟾科Discoglossidae与铃蟾科Bombinatoridae亲缘关系较近；新蛙亚目内蟾蜍科Bufonidae与雨蛙科Hylidae，蛙科Ranidae与树蛙科Rhacophoridae两两亲缘关系较近．蛙科中泽陆蛙Fejervarya limnocharis与大头蛙属3个种首先形成姐妹群，表明其较近的亲缘关系，同时推断大头蛙与福建大头蛙Limnonectes fujianensis亲缘关系近于脆皮大头蛙．     

虹鳟腺苷酸转移酶基因2(ant2)cDNA克隆与蛋白结构分析

腺苷酸转移酶(ANT)是位于线粒体内膜上参与能量分子传导的转运蛋白,在细胞凋亡调控网络中发挥重要作用.以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了虹鳟鱼ant2基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ591153).该序列全长1276 bp,其中5'端非翻译区长66 bp,3'端非翻译区长316 bp,开放性阅读框长894 bp,编码297个氨基酸.该蛋白具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域和3个转膜区.通过与其他脊椎动物腺苷酸转移酶蛋白序列的比较,发现该基因具有高度保守性,氨基酸序列的同源性均在90%左右.同源模建显示其与牛的线粒体ADP/ATP载体,chain A蛋白有相同的孔洞(cavity)结构.     

江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因的克隆及测序

从江浙蝮蛇毒腺中抽提总RNA，RT－PCR进行体外扩增，获得江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因，克隆至pGEX-5X-3载体中，对3个重组克隆分别作DNA全序列分析，通过遗传密码推导出相应的氨基酸序列，与其它已知的丝氨酸复白酶蛇毒蛋白的氨基酸作比较，其中许多上氨基酸有很强的同源性，该基因的成功克隆，不仅推导出江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子的蛋白质序列，也为进一步开展江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子蛋白质工程的研究工作打下良好的基础。     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP7O基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列.用半定量PCR方法研究了HSP70 mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况.结果表明:HSP70cDNA全长为2664 bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1917 bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3 kD.HSP70基因不含内含子.氨基酸序列分析发现,推导的氨基酸序列含有HSP70家族的3个标签序列(I10 DLGTTYS17,V198 FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKV QK350).氨基酸序列同源性比较显示HSP70与紫贻贝(Mytihcs galloprovincialis)和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)氨基酸序列同源性分别为79.47％和77％.半定量PCR分析显示在正常褶纹冠蚌血液、外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺5种组织中均能检测到HSP70的基因表达.经过热休克或病原菌刺激后,蚌各组织中HSP70 mRNA的表达显著增加,其中热休克处理后,蚌的鳃和血液中HSP70 mRNA表达量增加最为显著;而嗜水气单胞菌刺激后蚌的肌肉和鳃组织中HSP70 mRNA表达量增加最明显.     

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒的增殖 ,纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒 提纯的病毒粒子经SDS 酚抽提 ,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA ,低熔点琼脂糖电泳法回收纯化编码多角体蛋白的第十片段S10 S10经DMSO变性 ,逆转录合成cDNA第一条链 ,PCR扩增后 ,克隆在PMD18 T载体上 ,克隆片段全长 76 3bp 起始密码AUG位于第 3～ 5位碱基 ,终止密码UGA位于第 74 7～ 74 9位碱基 推测DpwCPV多角体蛋白基因编码一段由 2 4 9个氨基酸组成的多肽 ,分子质量为 2 84 39.4 4× 10 3 与舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)多角体蛋白基因比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 97% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 99% ;与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)多角体蛋白基因相比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 88% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 97%     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.     

刺参杀菌通透性增强蛋白N末端结构域重组蛋白的制备及功能分析

通过克隆刺参杀菌通透性增强蛋白(Bactericidal Permeability-increasing Protein, BPI)N末端的cDNA序列并进行原核表达, 获得了N端活性片段体外重组蛋白, 分析其抑菌谱. 结果表明: 刺参BPI蛋白N末端cDNA全长642bp, 编码214个氨基酸; 体外表达获得了分子量为30kDa的重组蛋白, 该蛋白对副溶血弧菌、哈维氏弧菌和藤黄微球菌均具有明显的杀菌作用, 其中对副溶血弧菌活性最强, 抑菌圈直径达2.5cm.     

草鱼IFI58基因的鉴定及其表达分析

草鱼IFI58全长cDNA为1764 bp,其中ORF为1440 bp,编码1个479 aa的蛋白。草鱼IFI58包含有10个TPR 34肽结构域,并与哺乳类IFIT相对应。其中,TPR7被中间插入序列分为TPR7A和B,TPR4也有5个氨基酸插入,TPR3只有B部分而缺少A部分。鱼类IFI基因与哺乳类的同源性不高,系统进化树也显示它     

墨胸胡蜂毒腺基因cDNA文库的构建及鉴定

从墨胸胡蜂毒腺中提取总RNA，经Oligo(dT)磁珠纯化mRNA后，用AMV反转录酶合成第一链cDNA．完成第二链cDNA合成后，过柱纯化50bp以上的片段，与载体pUC118连接，转化E．coli JM109，建立了cDNA文库．得到的780个阳性克隆中，重组率达到98．5％．大部分插入片段在500～900bp．随机挑选10个短序列测序，一个为蜂毒激肽基因序列．     

乌龟线粒体细胞色素b基因片段的初步研究

于2004年3月从浙江省级中华草龟良种场采集5只乌龟（Chinemys reevesii）．参照鱼类的线粒体细胞色素b基因序列设计合成1对引物，扩增了乌龟的细胞色素b基因片段，并对扩增产物进行序列测定分析．结果在5个个体中都获得序列相同的细胞色素b基因片段，长度为408bp，其中A、T、G、C含量分别为125bp（30．6％）、113bp（27、7％）、51bp（12．5％）、119bp（29．2％），与其他水生动物相同基因片段碱基序列含量相似．     

稀有鮈鲫（Rare gudgeon）Sox基因的克隆及序列分析

根据人的SRY基因中HMG-box保守区设计引物，采用PCR技术在稀有鮈鲫雌雄个体基因组DNA中分别扩增，发现3个大小分别为220、700和1500bp的片段，经过克隆和测序分析，从220bp的片段中获得两个基因片段，证明为稀有鮈鲫的Sox1和Sox21基因片段，无性别差异，其DNA序列与人及斑马鱼相应Sox基因相似性分别为Sox1：80．4％和97％；Sox21：77．3％和9l％，其编码的氨基酸序列与人及斑马鱼相应SOX蛋白相似性分别为Sox：96％和98％；Sox21：88％和100％，显示了其高度的保守性．此外，从GenBank、MEBL和DDBJ数据库获得了92个已克降的物种SRY和Sox基因全长核苷酸编码序列及HMG保守区序列数据．通过对这些数据进行序列比对及策类树的构建，分析了Sox基因家族成员的分类及分子进化模式，对稀有鮈鲫的性别决定进行了探讨，为Sox基因的进化研究提供分子基础．     

扁穗冰草PLD基因cDNA序列克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR技术和RACE方法克隆得到扁穗冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn)PLD基因cDNA的全长,并对该cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、进化树、二级结构、三级结构、无序化特性进行了预测和分析.结果显示:扁穗冰草PLD基因具有2967个核苷酸,含有PLD所特有的HKD基序和C2结构域,属亲水性蛋白,二级结构以无规卷曲为主,蛋白质的三级结构显示两个HKD基序靠近形成具功能的活性位点,蛋白质无序化分析发现无序化区域较少;进化树分析表明与蒙古冰草亲缘关系最近,与草莓亲缘关系最远.为研究扁穗冰草PLD在干旱胁迫信号转导及应答过程的机理奠定基础.     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP70基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列。用半定量PCR方法研究了HSP70mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况。结果表明:HSP70cDNA全长为2 664bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1 917     

用PCR技术检测生物硝化池污水中硝化细菌(Nitrobacteria)的研究

从生物硝化池污水水样中分离了硝化细菌ＤＮＡ,以其为模板,针对其１６ＳｒＲＮＡ基因及２３ＳｒＲＮＡ基因而设计合成了两对引物并分别进行了ＰＣＲ扩增,扩增产物的２％琼脂糖凝胶电泳结果显示,硝化细菌ＤＮＡ模板得到了特异性扩增．参照分子量标准（Ｍａｒｋｅｒ）的电泳结果,被扩增的ＤＮＡ条带大小分别约为４００ｂｐ和７３０ｂｐ．实验结果表明ＰＣＲ技术可用于污水中硝化细菌的快速检测     

用PCR技术检测生物硝化池污水中硝化细菌(Nitrobacteria)的研究

从生物硝化池污水水样中分离了硝化细菌DNA,以其为模板,针对其16Sr RNA基因及23Sr RNA基因而设计合成了两对引物并分别进行了PCR扩增,扩增产物的2%琼脂糖凝胶电泳结果显示,硝化细菌DNA模板得到了特异性扩增．参照分子量标准（Marker）的电泳结果,被扩增的DNA条带大小分别约为400bp和730bp．实验结果表明PCR 技术可用于污水中硝化细菌的快速检测．     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX的克隆与表达分析

根据NCBI基因数据库提供的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)基因序列设计简并引物,以青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片cDNA和DNA为材料进行PCR扩增,基因定名为BoAPX(Gen-Bank登录号:HQ871864).BoAPX的基因组全长为1 394bp,具7个内含子,编码区全长为753bp,编码250个氨基酸残基.序列分析结果表明,BoAPX的N端中没有信号肽序列,为胞质型APX,BoAPX与已知APX具有较高的同源性.RT-PCR结果表明,BoAPX的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)诱导,在96h时达最大值,说明BoAPX与霜霉菌抗性相关.以pBI121为植物表达载体,BoAPX为目的基因,成功构建了重组表达载体pBI121-BoAPX.