长时程双光子成像技术

双光子成像(Two-Photon Imaging)技术以其优越特性被广泛用于活细胞动态三维成像,但光功率极高的短脉冲光对焦平面荧光分子严重的光漂白极大地影响了双光子长时间成像的图像质量,针对双光子荧光漂白问题,本文提出一种优化光照的双光子(Optimized Lighting-Two Photon,OL-TP)成像技术。通过预扫描获取双光子图像分析高低阈值,以预设的高低阈值为标准优化一幅图像中不同区域的光照时长,利用扫描过程中记录的荧光信息和光照时间信息可以重建OL-TP图像,既保证信噪比又降低荧光漂白。重建的OL-TP图像与传统双光子图像基本一致,信噪比略有降低,但图像并未失真。对110 nm的荧光小球样本分别连续取30幅普通双光子和优化光照的双光子图像,到第30幅图时,重建后的优化光照双光子图像比普通双光子图像荧光漂白降低了28.86%。OL-TP通过优化光照时间大幅降低双光子成像的荧光漂白,使双光子荧光显微镜能够更好地对生物样本进行长时间观测。     

利用近红外光激发的光声血管造影成像

利用近红外光结合对应波长的光吸收增强对照剂来实现在体小鼠脑皮层血管的光声成像.近红外光在生物组织上有较深的穿透能力;而作为光吸收增强剂的外源染料吲哚菁绿注射到血液系统后则增加了血管对光的选择性吸收,从而增强了血管光声信号的强度.实验在不破坏脑头皮和头盖骨的前提下,通过静脉注射吲哚菁绿,获得小鼠脑皮层血管的光声造影成像.光声重建的血管网络与小鼠脑部解剖照片相当符合.实验结果证明近红外光结合光吸收增强剂的光声血管造影技术对于开展光声脑功能成像,光声分子成像提供了潜在的可行性. 关键词： 光声成像 光吸收增强剂 血管造影 光声信号     

眼底视网膜色素上皮层细胞脂褐素及氧化黑色素自体荧光寿命成像研究

利用一种基于时间相关单光子计数器的双光子激发荧光寿命显微成像技术,对猪眼底视网膜色素上皮层细胞内的脂褐素和氧化黑色素颗粒的空间分布及其荧光寿命特性进行了研究,尤其对于这些色素颗粒在光致氧化环境中的荧光寿命差异进行了分析.结果表明,利用荧光寿命测量能有效区分视网膜色素上皮层细胞中的多组分荧光团,利用荧光寿命的衰减参数可分辨正常及异常的荧光现象.该方法有望发展成为一种用于眼科临床诊断及病理学研究的高灵敏度的工具,对眼底细胞随年龄增长的衰老机理的研究具有重要的意义. 关键词： 双光子激发荧光 荧光寿命成像 视网膜色素上皮层     

眼底视网膜色素上皮层细胞脂褐素及氧化黑色素自体荧光寿命成像研究

利用一种基于时间相关单光子计数器的双光子激发荧光寿命显微成像技术，对猪眼底视网膜色素上皮层细胞内的脂褐素和氧化黑色素颗粒的空间分布及其荧光寿命特性进行了研究，尤其对于这些色素颗粒在光致氧化环境中的荧光寿命差异进行了分析.结果表明，利用荧光寿命测量能有效区分视网膜色素上皮层细胞中的多组分荧光团，利用荧光寿命的衰减参数可分辨正常及异常的荧光现象.该方法有望发展成为一种用于眼科临床诊断及病理学研究的高灵敏度的工具，对眼底细胞随年龄增长的衰老机理的研究具有重要的意义.     

多光子成像技术的生物医学应用新进展

多光子成像技术由于具有低侵入性、强穿透力、高空间分辨率等优点,自问世以来便成为生物医学研究的有力工具,在癌症病理、神经疾病及脑功能成像等方面取得了一系列较好的研究成果.目前,应用较为广泛的多光子成像技术是双光子激发荧光显微成像技术,其在生物医学应用中具有较大的发展潜力.本文详细阐述了多光子成像技术在多色成像、功能成像及成像深度等方面的生物医学应用新进展,包括多色双光子激发荧光显微成像、双光子激发荧光寿命显微成像、双光子光纤内窥成像和三光子显微成像技术,并简要介绍这几种多光子成像技术的原理与特性,最后展望其未来发展前景.     

脉冲压缩在双光子荧光显微成像中的应用研究

本刊讯自20世纪90年代末,双光子荧光显微成像技术已经逐步成为利用光学手段研究生物组织和细胞的重要工具。由于双光子激发属于非线性光学过程,     

飞秒光镊技术及其发展

激光捕获技术是利用光辐射力来捕捉、移动和操纵微粒的先进技术。飞秒光镊在实现粒子微纳操纵的同时还伴随着非线性现象的发生。阐述了飞秒光镊的模型和原理以及系统的各种结构形式,包括单光束梯度力光阱、贝塞耳光阱、双光束光纤光阱和冲击波光阱几种形式,并分析了每种形式的特点。     

多色双光子激发荧光显微技术实验研究

双光子激发荧光(two-photon excited fluorescence, TPEF)显微是一种非线性光学显微技术, 具有高的时间分辨率和空间分辨率、高的信噪比和固有的三维层析分辨能力等优点. 传统的TPEF显微一般采用波长可调谐的超短脉冲激光器作为光源. 在实际应用中, 利用TPEF显微技术研究含有多种荧光团或未知成分的待测样品, 往往需要多次改变激发光的波长以获得对各种荧光团的最佳激发. 为了同时获取不同荧光团的荧光信号, 利用超连续谱激光光源实现了多色TPEF显微成像, 实验中无需调节波长, 能够同时获得具有两种不同发射波长的荧光标记的铃兰根茎切片样品的TPEF图像. 实验结果表明, 与传统的TPEF显微相比, 该方法能够同时获取含有多种荧光团的待测样品的高对比度TPEF图像, 具有系统结构简单、操作简便、信息量大等优点, 在生物医学和材料科学等领域具有广阔的应用前景.     

不同波长激发光对血清荧光光谱影响的实验研究

采用日本岛津荧光光度计RF5301,研究了血清的荧光光谱与激发光波长的关系。实验结果表明：在不同波长的紫外光激励下,血清产生的荧光光谱线型及峰值波长基本相同,与激励光波长无关,但荧光峰强度随激励光波长变化而变化。血清的荧光光谱有两个较强的荧光发射区,其中第一个发射区处于300～410 nm,第二个发射区处于410～530 nm。当激发光波长小于310 nm,荧光主要集中在第一发射区,荧光峰位于330和370 nm处,并产生竞争现象。当激发光波长大于250 nm时,只出现330 nm处的荧光峰,其最佳激励光波长为300 nm;当激发光波长大于320 nm,第一发射区的荧光变弱,在第二发射区的荧光变强,荧光峰位于452 nm。此研究为血液的光谱特性研究提供了实验依据,对光诱导荧光光谱诊断技术中激发光波长的选择具有一定的参考价值。     

单个牛视网膜神经细胞内游离Ca2+动态变化的实时观测方法

为观测神经营养因子对胞内Ca2+浓度的影响,将牛视网膜神经细胞内的Ca2+用Fluo-3标记,用搭建的活细胞实时成像荧光显微系统对其成像,并观测在脑源性神经营养因子BDNF等四种神经营养因子的作用下细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]_i)随时间的变化的规律。由于荧光分子有自发衰减效应,故对得到的细胞内荧光强度采用“去衰减效应修正”的处理方法,再现了较真实地代表[Ca2+]_i的荧光强度。修正后的数据显示,加入四种神经因子后,[Ca2+]_i皆有不同程度的升高,与相关文献所描述的类似实验具有相似结果,说明此种对活细胞内荧光标记物的实时动态成像的实验方法可行,去衰减效应修正的数据处理方法可靠。     

基于环形光瞳提高荧光辐射差分超分辨显微镜的成像分辨率

荧光辐射差分(FED)显微术利用实心光斑扫描的一幅共聚焦图像减去空心光斑扫描的负共聚焦图像,实现了超分辨成像。使用简单的环形光瞳滤波器提高了无变形FED的成像分辨率。在空心焦斑光路上使用合适的环形光瞳滤波器,压缩空心焦斑的尺寸;同时,在实心焦斑的光路上允许使用更高数值孔径的孔径光阑,获得更小的、与空心焦斑相匹配的实心光斑分布:两方面作用下,提高了FED的空间分辨率。     

基于ICCD的快速荧光显微成像技术及在活细胞研究中的初步应用

利用像增强型CCD、氩离子激光器和氙灯等建立了一套快速荧光显微成像系统,并初步应用于活细胞研究。实时观测和拍摄了大鼠脑微血管内皮细胞增殖分裂过程中细胞内钙敏感荧光探针Fluo-3标记的钙离子浓度分布快速变化的图像,并选取动态图像中四个典型的点给出荧光强度灰度值的变化曲线。该系统可用于高灵敏实时记录活细胞内基于荧光显微成像的快速变化过程,为活细胞的研究提供了一种很好的观察和分析手段。     

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。     

Fura－2双波长荧光法测定蟾蜍骨骼肌细胞肌浆中的自由钙离子浓度

本文对应用Ｆｕｒａ－ＺＡＭ荧光法测定细胞肌浆中的自由钙离子浓度时几种影响其测量精度的因素进行了讨论，提出了用化学去膜方法加以改进。在此基础上，测量了处于静息状态时完整蟾蜍骨骼肌细胞肌浆内自由钙离子浓度，其值为（１１６．８±５．３）×１０－９ｍｏｌ／Ｌ，而常用的方法得出相应的结果为（１２２．２±４．ｌ）×１０－９ｍｏｌ／Ｌ。     

基于数字微镜的快速轴向扫描系统

为解决双光子荧光显微成像系统轴向扫描问题,提出一种基于数字微镜(DMD)的快速轴向扫描系统。该系统采用DMD选择光路,不同光路放置不同焦距的透镜组对光束发散角产生不同的改变,经物镜聚焦后得到不同深度的轴上扫描点。对该系统的轴向扫描距离、扫描点位置及衍射效率进行了理论计算仿真,结果表明:扫描系统采用4个模块以及5个模块时其轴向扫描距离均可达到1 mm,4模块系统中透镜的焦距为297.3 mm,5模块系统中透镜焦距为361.47 mm。轴向扫描点除边缘点外线性分布, 轴向扫描频率达到几十kHz,满足脑神经成像的要求。     

基于高速相位型空间光调制器的双光子多焦点结构光显微技术

多焦点结构光照明显微镜(multifocal structured illumination microscopy,MSIM)能在50μm的成像深度内实现2倍于衍射极限分辨率的提升,但在对厚样品成像时,散射光和离焦光限制了其层析能力和图像衬度.双光子多焦点结构光照明显微镜(two-photon MSIM,2P-MSIM...     

光化学汽相沉积中光激活物质的理论解析

基于光激活物质空间迁移长度的概念,推导出方形反应空间中到达基片上单位面积的光激活物质总数的解析表达式,对光化学汽相沉积中淀积速率和基片位置的关系进行了模拟和分析。 模拟结果同实验结果符合良好。     

滑动焦点光声显微成像方法

在高分辨光声显微成像系统中,只有在有限焦深范围内的吸收体可以获得高分辨率高信噪比的成像,而实际的生物组织往往具有不规则的轮廓,导致成像结果分辨率和信噪比不均匀。提出了一种基于稀疏扫描轮廓的滑动焦点光声显微成像方法,首先在固定的焦点上稀疏扫描轮廓,人工选择轮廓点获取轮廓的稀疏矩阵,然后通过双调和(Biharmonic)插值获取完整的轮廓矩阵,并将轮廓矩阵转化为焦点位置移动矩阵,最后进行二次扫描,根据焦点位置移动矩阵在每次扫描之前调整焦点位置,使得在整个扫描过程中,样品始终处于焦深的范围,从而获得分辨率和信噪比均匀的光声显微图像。通过模型实验和在体皮下血管成像、颅下血管成像,证明了该方法可以有效地提高光声成像的质量。     

双光子激发荧光成像技术对小鼠植入前胚胎的实时观测

双光子激发的蓝移效应可使利用同一束超快激光同时激发多种不同荧光特性的生物荧光染料的设想得以实现。选取锁模飞秒掺钛蓝宝石(Ti-sapphire)激光器输出的730nm激光,分别激发Hoechst33342,Fluo-4,PI和Indo-1四种常用生物荧光染料,分别利用(455±15)nm,(540±15)nm,(580±16)nm和(500±15)nm四种滤光片获得特异性荧光图像。结合双光子激发荧光成像技术穿透深,光损伤小,信噪比好等优势,选取合适的荧光染料组,应用单束激光激发、双染双通道成像方法,对小鼠植入前胚胎内细胞中的钙信号和染色体进行三维、四维实时成像,为探究小鼠植入前胚胎发育规律提供一种全新的多参数观测手段。     

结构光照明光切片显微图像的高保真重构方法

光切片图像的质量与使用的重构算法直接相关,传统的均方根算法虽然简洁,但在原始图像信噪比和条纹对比度不高时重构效果不佳,得到的三维重建结果并不理想。针对该问题,提出一种去背景和去卷积相结合的光切片方法。与传统均方根算法相比,该方法能有效减少残留条纹,提高微小细节的可见性。实验搭建了一套基于数字微镜器件的结构照明显微系统,以小鼠肾脏细胞、牛肺动脉内皮细胞等为样品进行了光切片实验。实验结果表明,该方法能获得更好的光切片和三维成像效果。