基于稳定同位素标记的蛋白质组学定量方法研究进展

定量蛋白质组学已经成为后基因时代的重要研究方向之一。目前该领域的研究主要采用无标记定量方法和稳定同位素标记定量法。其中,基于稳定同位素标记的蛋白质组定量方法发展非常迅速,已为生命科学研究提供了重要的技术支撑。本文分析了基于稳定同位素标记的蛋白质组学定量方法,包括相对定量方法和绝对定量方法,并对其发展进行了展望。     

基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记定量蛋白质组学方法的建立与优化

建立了一种基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记,定量蛋白质组学研究方法,优化了影响标记效率的各种条件。在pH8.0的Na2B4O7/H3BO3缓冲体系中,当乙酸酐摩尔浓度25倍过量于肽段摩尔量,22℃反应30 min时,标记即可完全。对多对H6/D6-乙酸酐标记肽段在基质辅助激光解吸电离质谱中的动态范围及定量准确度进行了考察,并通过串联质谱分析确定了乙酰化位点。结果表明:在10倍和30倍动态范围内,线性关系良好(r=0.99,r=0.98),理论值和观测值的偏差分别为0.5%和20%。     

用于质谱的稳定同位素化学标记技术

近年来,稳定同位素化学标记结合质谱技术在定量蛋白质组学、代谢组学及转化医学等领域得到了广泛的应用.从同位素标记的官能团的角度进行了分类,除了传统的、商品化的同位素标记技术,还综述了一些最新报道的针对巯基、氨基和羧基等基团的特异性和非特异性同位素标记的策略及应用等方面的研究进展,并对此方面的发展趋势和应用前景进行了展望.     

基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记

建立了一种基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记,定量蛋白质组学研究方法,优化了影响标记效率的各种条件.在pH 8.0的Na2B4O7/H3BO3 缓冲体系中,当乙酸酐摩尔浓度25倍过量于肽段摩尔量,22℃反应30 min时,标记即可完全.对多对H6/D6-乙酸酐标记肽段在基质辅助激光解吸电离质谱中的动态范围及定量准确度进行了考察,并通过串联质谱分析确定了乙酰化位点.结果表明: 在10倍和30倍动态范围内,线性关系良好(r=0.99, r=0.98),理论值和观测值的偏差分别为0.5%和20%.     

基于稳定同位素标记和平行反应监测的蛋白质组学定量技术用于肝癌生物标志物的筛选和验证

肝癌是全球第五大恶性肿瘤,其五年生存率极低,及早地发现与诊断对肝癌的临床治疗具有重要意义。通过结合体外稳定同位素标记的蛋白质组学相对定量技术和基于平行反应监测的靶向蛋白质组学定量技术,建立了一种癌症生物标志物的筛选和验证方法。该方法被用于肝癌组织的差异蛋白质筛选和后期验证,共筛选到70个在癌组织中显著变化的蛋白质,并对其中7个蛋白质进行了验证。所验证的蛋白质包括已在临床使用的肝癌标志物甲胎蛋白(AFP)和文献报道的潜在肝癌生物标志物热休克蛋白(HSP90)、脂肪酸结合蛋白5(FABP5)和乙醇脱氢酶4(ADH4),说明了该方法的可靠性。该文所筛选的差异蛋白质可以为肝癌生物标志物研究和临床验证提供参考;该方法还可用于其他癌症样品的差异蛋白质筛选和验证。     

18O稳定同位素标记定量蛋白质组研究技术的建立与优化

建立了18O稳定同位素标记方法,用于复杂体系蛋白质相对定量分析。对影响蛋白质标记稳定性的实验条件进行了比较和优化。结果表明,采用酶切后标记的方法,酶切肽段在胰酶催化下,在pH 5.0的K2HPO4/KH2PO4缓冲体系中,37℃18O标记反应16 h,绝大部分肽段即可达到100%的标记效率。对多个16O/18O成对肽段峰强度的动态范围及定量准确度进行了考察。结果表明,18O标记方法是一种简便、稳定、可靠的相对定量方法,10倍动态范围内,标记率相对标准偏差在18.4%以内,16O/18O峰强度呈很好的线性关系。本实验考察了标记后的肽段在不同溶液体系中的稳定性,为复杂样品的预处理和预分离的溶液条件提供了依据。     

PC12细胞重离子辐射生物学效应的比较蛋白质组学研究

在太空探索尤其是深空探索之前,必须了解清楚重离子辐射对宇航员健康的威胁。本文使用2Gy剂量的碳离子束辐射PC12细胞,并在继续培养24h之后采用基于定量驱动的比较蛋白质组学方法分析重离子辐射引起的蛋白表达变化。结果显示,重离子辐射后的细胞和对照相比,共有15个蛋白在表达水平上发生显著差异。在这些差异蛋白中,较多蛋白属于热休克蛋白,在生物途径上多数和细胞凋亡有关。这些差异蛋白的鉴定,有助于进一步研究重离子辐射生物学效应的分子机制。     

核酸工具酶辅助的金属稳定同位素标记方法在生物分析中的应用

本文主要概述了近年来核酸工具酶辅助的基于金属稳定同位素标记的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测方法在生物分析中的发展和应用,简要介绍了该方法在蛋白质、核酸及一些生物小分子检测中的应用。最后对核酸工具酶辅助的基于金属稳定同位素标记的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测方法的发展前景做了展望。     

稳定氯同位素分析技术及其在有机氯污染物研究中的应用

有机氯污染物是近几十年环境科学持续关注的热点,传统研究以环境化学为主。随着同位素分析技术日趋高效便捷,氯同位素分析技术也开始在有机污染研究中得到更多应用。本文综述了稳定氯同位素分析技术的研究进展,介绍了氯同位素技术在有机污染物研究中的应用现状,并对其研究趋势进行了展望。单体同位素分析技术有助于开展有机氯污染物的同位素相关理论及应用研究;双路-同位素质谱和热电离质谱方法是测试精度较高的两种氯同位素测试方法,但是前处理过程繁杂、样品用量较大,不能满足环境样品中痕量的有机氯污染物分析;在线同位素测试技术提高了分析方法的灵敏度,拓宽了单体氯同位素分析技术在环境有机污染研究中的应用范围,是未来环境有机污染研究的趋势之一, 有待深入研究。目前氯同位素分析主要应用在环境有机污染物的溯源、降解途径的辩识和降解效率的量化等方面,尚需加强相关理论和应用研究。     

稳定同位素氘标记D_6-结晶紫的合成及表征

以D4-甲醇为原料,通过酯化、N-甲基化、缩合等过程合成得到稳定同位素标记D6-结晶紫,利用均匀设计法,研究了投料比、三氯氧磷用量、反应温度和反应时间对合成结晶紫的影响。实验数据通过多元回归分析,得出了优化的工艺条件。目标产物的结构经质谱(MS)、核磁(NMR)和高效液相色谱(HPLC)等表征,化学纯度高于98.0%,同位素丰度高于99.5%(atom D),可作为食品安全领域检测用同位素内标试剂。     

基于稳定同位素标记与质谱分析的蛋白质定量算法研究进展

蛋白质定量研究已成为蛋白质组学的热点,它是疾病相关生物标志物发现的重要途径.基于稳定同位素标记的质谱分析技术是蛋白质定量最常用的方法之一.随着实验方法的发展和改进,定量数据处理方法也在不断更新与完善.一般来说,定量数据处理包括四步:搜库鉴定、图谱定量信息提取与计算、肽段丰度比计算和蛋白质丰度比计算及差异显著性分析,其中后三步是数据处理的核心.目前,后三步中每步都有多种可选算法,这些算法一般都是针对特定实验技术而提出的,缺乏深入的工作对它们进行系统比较和优化.为此,在总结目前主要实验技术方法的基础上,论述了定量算法的现状和存在问题,并针对一些问题提出了可行的解决办法.     

六六六异构体稳定碳同位素组成分析

采用GC-C-IRMS、EA-IRMS和Dual-inlet IRMS 3种稳定同位素比值质谱仪分别对六六六的α、β和γ3种异构体的稳定碳同位素组成进行了分析。对比3种分析系统测定的碳同位素组成数据表明GC-C-IRMS系统能够准确和精确地测定六六六碳同位素组成。应用GC-C-IRMS技术分析了水样品中α-和γ-六六六的碳同位素组成,结果表明六六六在溶解、稀释、萃取、挥发等过程碳同位素组成没有分馏现象。采用GC-C-IRMS技术分析环境样品中持久性有机氯农药稳定碳同位素组成可能得到广泛应用。     

液相等电聚焦结合乙酰化标记在比较蛋白质组学中的应用

建立了液相等电聚焦,一维电泳分离以及肽段乙酰化同位素标记的新技术,此技术在1∶5~5∶1范围内具有较好的动态范围(误差小于20%)。本方法不仅可以提高比较蛋白质组分离的通量,并有助于低丰度差异蛋白中的检出;并成功应用于正常肝脏与癌变肝脏组织的低丰度、偏碱性蛋白的差异比较蛋白质组分析,鉴定出16种差异蛋白,结果令人满意。     

Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review

The quantification of differences between two or more physiological states of a biological system is among the most important but also most challenging technical tasks in proteomics. In addition to the classical methods of differential protein gel or blot staining by dyes and fluorophores, mass-spectrometry-based quantification methods have gained increasing popularity over the past five years. Most of these methods employ differential stable isotope labeling to create a specific mass tag that can be recognized by a mass spectrometer and at the same time provide the basis for quantification. These mass tags can be introduced into proteins or peptides (i) metabolically, (ii) by chemical means, (iii) enzymatically, or (iv) provided by spiked synthetic peptide standards. In contrast, label-free quantification approaches aim to correlate the mass spectrometric signal of intact proteolytic peptides or the number of peptide sequencing events with the relative or absolute protein quantity directly. In this review, we critically examine the more commonly used quantitative mass spectrometry methods for their individual merits and discuss challenges in arriving at meaningful interpretations of quantitative proteomic data.     

热表面电离同位素质谱在人体钙同位素示踪研究中的应用

研究了用热表面电离质谱测量经同位素示踪的人尿中钙同位素丰度比的方法。方法主要涉及生物样品的化学前处理程序和质谱测量技术,并就不同的样品前处理方法等因素对测量结果的影响进行了讨论,测量结果用于钙吸收率的计算。     

加速器生产医用同位素211At及单抗标记

²¹¹At, 半衰期7.2 h, 发射的α粒子具有很高的线性传能密度, 是一种理想的靶向α治疗核素. 利用中国科学院近代物理研究所强流超导直线加速器提供的α束流辐照Bi靶生产²¹¹At, 系统考察了加速器生产²¹¹At的整个流程, 包括加速器辐照、干蒸馏分离、质量分析以及单抗标记. 研究结果表明, 干蒸馏分离²¹¹At的总收率最高达78.53%, 获得的固体²¹¹At产品具有极高的比活度、核纯度以及化学纯度, 其中杂质元素Bi、Cu、Zn、Al含量均低于100 ng/GBq, 且入射粒子能量低于28.2 MeV时, N(²¹⁰At)/N(²¹¹At)值低于10^–5, 研究也实现了²¹¹At在尼妥珠单抗上的标记, 标记率高达94.86%. 基于以上研究我们确立了一套简单、高效的分离方法, 为后续我国²¹¹At的生产和应用奠定了良好基础.     

A Nickel(II)-Mediated Thiocarbonylation Strategy for Carbon Isotope Labeling of Aliphatic Carboxamides

A series of pharmaceutically relevant small molecules and biopharmaceuticals bearing aliphatic carboxamides have been successfully labeled with carbon-13. Key to the success of this novel carbon isotope labeling technique is the observation that ¹³C-labeled Ni^II-acyl complexes, formed from a ¹³CO insertion step with Ni^II-alkyl intermediates, rapidly react in less than one minute with 2,2’-dipyridyl disulfide to quantitatively form the corresponding 2-pyridyl thioesters. Either the use of ¹³C-SilaCOgen or ¹³C-COgen allows for the stoichiometric addition of isotopically labeled carbon monoxide. Subsequent one-pot acylation of a series of structurally diverse amines provides the desired ¹³C-labeled carboxamides in good yields. A single electron transfer pathway is proposed between the Ni^II-acyl complexes and the disulfide providing a reactive Ni^III-acyl sulfide intermediate, which rapidly undergoes reductive elimination to the desired thioester. By further optimization of the reaction parameters, reaction times down to only 11 min were identified, opening up the possibility of exploring this chemistry for carbon-11 isotope labeling. Finally, this isotope labeling strategy could be adapted to the synthesis of ¹³C-labeled liraglutide and insulin degludec, representing two antidiabetic drugs.