毛细管电泳法快速分离和检测肠毒性大肠杆菌

 建立了快速分离和检测引起仔猪腹泻的肠毒性大肠杆菌K88、K99和 987P细菌细胞的毛细管区带电泳方法 ,并进行了腹泻仔猪粪便中肠毒性大肠杆菌的应用检测分析。结果表明 ,在电泳缓冲液为 0 0 5mol/LNa2 CO3 NaHCO3(pH 9 9)、分离电压为 1 4 1kV、检测波长为 2 1 0nm的电泳条件下 ,E coliK88、K99和 987P的细胞分别具有单一、稳定的特征谱峰 ,其保留时间的相对标准偏差RSD≤ 0 9% ;在确定的实验条件下 ,实现了腹泻仔猪粪便中肠毒性大肠杆菌的快速检测分析 ,发现将出生 5d～ 6d的腹泻仔猪粪便引入培养基中增殖后主要检出K88。     

表达K_(99)和F_(41)双价保护性抗原工程菌株的构建及免疫效果研究

本文应用基因重组技术,将引起犊牛、羔羊大肠菌腹泻的主要致病因子的保护性抗原基因K_(99)和F_(41)从野生株先分别克隆,然后组构成同时表达两种抗原的工程菌疫苗候选株。研究了该工程菌表达的两种抗原的性质,影响表达的条件。同时经过免疫怀孕母羊然后进行人工攻毒及田间大面积免疫羊群,证明该工程疫苗候选株能有效诱发机体的免疫应答,对羔羊有显著地保护作用。     

大肠杆菌(Escherichia coli)K99抗原基因在小肠结肠炎耶氏菌(Yersinia enterocolitica)中的表达

本文通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向免疫扩散及Western吸印实验,证明大肠杆菌(Escherichia coli)K99抗原基因在小肠结肠炎耶氏菌(Yersinia entero-colitica)无毒菌株D29(pFS239)和L15(pFS239)中表达,比较了K99基因在Y. enterocolitica与E. coli中表达条件的异同,并推测K99抗原蛋白在Y. ente-rocolitica中以纤毛的状态存在于细胞表面。本文是关于不同属的经克隆的基因在Y. enterocolitica中进行表达的首次报道。     

单链抗体PS-9的基因克隆、表达和免疫特性鉴定

成功地构建了鼠抗人胰腺癌单克隆抗体PS-9的单链抗体可变区基因(V_H-linker-V_L),并将该基因克隆到噬菌体表达载体pCANTAB5的外壳蛋白g3p基因中,使单链抗体以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面。免疫学鉴定结果表明,这种噬菌体抗体仍保留着亲代抗体的免疫特性,能与人粘液细胞癌LS-174-T细胞表面抗原特异结合。这项研究结果有助于鼠源性单克隆抗体的临床应用以及肿瘤导向诊断和治疗。     

志贺氏毒素B亚单位在大肠杆菌细胞表面表达的研究

本文通过寡核苷酸引导的定向诱变,将志贺氏毒素B亚单位的三个部分(Stx17B,Stx27B和StxB)融合至暴露在细菌表面的LamB蛋白的第153和154氨基酸之间的BamHⅠ位点。免疫印迹指出,B亚单位的三个部分作为与LamB的融合蛋白能在大肠杆菌中表达。间接免疫荧光和免疫电子显微镜分析表明:融合蛋白LamB/Stx17B和LamB/Stx27B能表达在大肠杆菌细胞表面,而融合蛋白LamB/StxB则不能在大肠杆菌表面表达,它聚集在细胞间质部分,对宿主细胞有毒性。将保护性抗原表达于细菌表面,这为构建预防志贺氏痢疾杆菌的菌苗后选株提供了一个新的途径。     

促进动物生长的新型基因工程疫苗研究

将动物生长抑素(ss)基因融合到乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因3′末端,构建融合基因重组痘苗病毒。重组病毒(vv-HBs/ss)能表达HBsAg杂合颗粒,并将ss抗原决定簇暴露在颗粒表面。以vv-HBs/ss作为活载体苗免疫家兔,能刺激产生ss抗体;免疫大鼠,能促进生长。     

表达烟草花叶病毒外壳蛋白的转基因烟草及其对TMV的抗性

利用体外重组DNA技术构建携带烟草花叶病毒(TMV,国内流行的普通株)外壳蛋白基因(CP)的中间表达载体,通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒,重组TMV-CP基因被转移至烟草细胞,并获得大量再生的转基因烟草。工程烟草的基因组经Southern印迹法分析证明,CP基因在再生工程株染色体中有1—5个拷贝的插入。分子杂交分析确证TMV-CP基因在转基因株中获得正确表达,其mRNA和蛋白产物的丰度分别达0.005—0.01％及0.05—0.2％。攻毒实验表明90％以上的能表达TMV—CP基因的工程烟草能不同程度地抑制病毒的复制、扩散,并显著延缓,减轻系统病状的发生。有3株工程植株直至花期无病状表现,生长正常。这一抗性作用机制在于转化细胞中的外壳蛋白在病毒侵染早期有效地抑制了入侵病毒颗粒的脱壳,从而阻断病毒的复制。     

一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法

本发明属于生物技术领域,公开了一种敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX58的高效表达系统与分离纯化方法。本发明通过基因工程技术,采用表达质粒p VT102 U/α和酿酒酵母S78菌株构成的真核表达系统,经过分离纯化、质谱分析鉴定成功表达得到敬钊毒素58(JZTX58)蛋白质,解决了直接从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化而很难得到足量毒素来进行功能研究的难题,为进一步研究JZTX58的抗疟原虫活性奠定了重要的基础。     

以β-半乳糖苷酶为标记选出高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的天坛株重组痘苗病毒

我们从天坛株痘苗病毒的基因组中,分离编码11K及25K蛋白的双向转录启动子,以胸苦激酶(TK)基因为旁侧序列,插入到质粒pAT153中,构建成可以同时表达两个外源基因的载体质粒,并将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因及大肠杆菌的β-半乳糖苦酶(LacZ)基因,插入该载体质粒,使它们分别在11K及25K启动子钠控制下,构建成共表达质粒。用钙沉淀法将此质粒DNA同天坛株痘苗病毒在细胞内进行同源重组,在含X-gal的培养基挑蓝色蚀斑,简便、准确地选出重组痘苗病毒。所选到的重组痘苗病毒高效表达了HBsAg。我们还把上述重组痘苗病毒接种动物,观察了它们的毒力及免疫原性。     

SARS病毒核衣壳蛋白的表达与鉴定

依据Genebank中SARS基因组序列和酵母菌对密码子的选择性,采用人工合成的方法,合成了优化的SARS病毒核衣壳蛋白(N)的全基因(1296bp),与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建成重组表达载体pPIC9K-N.重组载体转化毕赤酵母GS115,并经MD平板和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115-pPIC9K-N.用甲醇诱导其分泌表达目的蛋白并对表达产物进行分析、浓缩与鉴定.结果表明,SARS病毒核衣壳蛋白能实现在毕赤酵母中高效表达,表达量达到20%,初步纯化后的产物具有良好的抗原特异性.     

太谷核不育小麦遗传鉴定结果再验证及显性雄性不育八倍体小黑麦的人工合成

本文根据前人对太谷雄性不育小麦的研究结果,首先做出理论推导.然后用太谷雄不育小麦与黑麦杂交以产生多元单倍体植株并使其染色体加倍,使不育基因在人工条件下纯合化.结果表明,单倍体、双倍体以及双倍体植株的杂交后代,其雄蕊表现与分离比例都与事先做的理论推导高度相符,从而再一次肯定了太谷雄不育小麦的不育性确实是由显性单基因所决定的。 Tal基因在非单纯普通小麦遗传背景下也能正常表达,作者把Tal基因导入了八倍体小黑麦并已投入育种应用。     

一个HBsAg基因在大肠杆菌中的强表达系统

利用筛选启动基因的载体系统,从大肠杆菌染色体DNA中获得一个启动基因片段。在它的控制下HBsAg基因在大肠杆菌中有较强的表达。通过抗-HBs亲和层析柱分离纯化了表达产物。用琼脂糖双扩散免疫分析法和聚丙烯酰胺——SDS凝胶电泳对分离纯化的表达产物进行了鉴定。     

昆虫信息素缓释技术的研究进展

昆虫信息素是一类由昆虫个体释放于体外来调节或诱发同种其它个体行为与反应的化学物质。 近年来,应用昆虫信息素防治虫害是当前有机农业绿色防控的新技术之一。 与传统农药防治虫害相比,信息素具有高效、无毒、不产生抗药性以及对天敌无害的特点。 此外,昆虫信息素通常易降解且挥发性高。 因此,基于信息素的缓释技术引起了科研工作者的广泛关注,是涵盖化学、材料与农业的新兴交叉学科。 通过某种特定的方法或技术使昆虫信息素缓慢控制释放,既能有效防治虫害,减少农药使用,提升环境生态水平,同时也能促进区域环境化学品总量与农业成本的降低。 本文详细综述了昆虫信息素缓释技术的最新研究进展并对发展前景进行了展望。     

口蹄疫病毒3ABC基因截短体在毕赤酵母中的表达及鉴定

将长为525 bp的口蹄疫病毒3ABC基因截短体克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中, 构建了重组表达质粒pPIC9K-3ABCt. 用BglⅡ线性化后, 电转化毕赤酵母菌GS115, 经表型筛选, PCR鉴定, 获得阳性重组菌(GS115/pPIC9K-3ABCt). 然后进行诱导表达, 通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物. 结果表明, 重组菌株成功分泌表达了分子量为40000, 具有免疫反应活性, 且呈二聚体形式的目的蛋白. 在96 h时表达量达到最高峰, 占分泌总蛋白的18%, 达到23.4 mg/L. 为进一步研制口蹄疫免疫和感染动物鉴别诊断试剂奠定了基础.     

HIV-1嵌合抗原的纯化及免疫原性分析

为获得高效的HIV诊断试剂,选定HIV-1的外膜蛋白env中469-511aa,538-674aa和700-734aa3处包含较多抗原位点的区域作为免疫抗原,用PCR的方法从HIV-1全基因扩增编码这3处片段的基因序列,将它们克隆到原核表达载体中,利用大肠杆菌表达系统表达嵌合蛋白.结果发现,3段嵌合基因能在大肠杆菌BL21(Star)中表达,通过Ni-sepharose4B金属Ni螯合层析柱分离纯化目的产物,酶联免疫检测结果表明,纯化抗原有较强的抗原特异性.     

人三叶因子3双结构域突变体的构建

利用基因工程方法在大肠杆菌-酶母穿梭质粒pPIC9K上构建了人三叶因子3(HumanTrefoilFactor3,hTFF3)双结构域突奕体基因,采用毕氏酵母表达系统对目的基因进行了分泌表达。经S-Sepharose,Q-Sepharose,SephacrylS-100纯化后得到突变体蛋白,主要以单体形式存在。SDS-PAGE表明重组蛋白分子量约为12000,并在Westernblotting印迹实验中证明能被抗hTFF3抗体所识别,N-端氨基酸测序与天然hTFF3-一致,质谱检测纯化的蛋白出现单体和双体两种形式。用重组蛋白对乙醇诱导的大鼠胃溃疡进行实验治疗表明hTFF3双体突变体与天然形成的双体蛋白具有相同的活力,并且活力高于单体形式的hTFF3。     

在重组痘苗病毒中共表达HIV-1p24gag与hIL-6基因

以ＨＩＶ－１ ｐ２４ｇａｇ 与ｈＩＬ－６ 基因在重组痘苗病毒中的共表达研究为目的,将痘苗病毒复制非必需区血凝素（ＨＡ） 基因作为侧翼,把编码人白细胞介素６（ｈＩＬ－６）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ＱＦ１ －２４ 的下游,构建成含有ＨＩＶ－ １ｐ２４ｇａｇ 和ｈＩＬ－６ 两种外源基因的重组表达质粒ｐ１６ＱＦ２４ －ＩＬ６ ,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选,获得了重组痘苗病毒ｖ１６ＱＦ２４ －ＩＬ６．经间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ ＥＬＩＳＡ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ 等检测证明,重组病毒能同时表达ｐ２４ｇａｇ 蛋白和ＩＬ－６ 蛋白,表达产物的相对分子质量分别为２－４×１０４ ,２－６×１０４ ．此种方式表达的外源蛋白持续释放,可产生更强的免疫效果,可望用于ＨＩＶ疫苗的研究．     

基因分析在急性白血病分型中应用的基础研究

本文应用分子杂交技术,从DNA和RNA水平探讨了一些细胞谱性相关基因在急性白血病分型中应用的可能性及意义。研究系统分析了免疫球蛋白重链(JH)和T细胞抗原受体β链(Tβ)基因重排以及Tβ,CD_3ε和髓过氧化物酶(MPO)基因mRNA产物与各型急性白血病的相互关系。结果表明,上述各基因的重排或表达均是和急性白血病细胞谱系相关的早期标志。将基因分析应用于临床急性白血病分型将可弥补现有分型手段的不足,提高急性白血病分型的精确性。     

长期喂饮钇对子代大鼠脑组织中基因表达的影响

通过在饮水中加入钇(0,53.4,5340 mg.L-1),使大鼠长期摄入稀土。7个月后,采用基因芯片技术检测F1子代大脑组织中的基因表达情况。结果显示,与对照组相比,高浓度组有787个基因发生了差异表达,其中505个上调表达,282个下高表达。差异表达基因与细胞受体、信号转导、离子通道有关;低浓度组有44个基因发生了差异表达,其中32个上高表达,12个下调表达。差异表达的基因与细胞骨架、细胞运动以及DNA结合蛋白密切相关。提示长期喂饮稀土钇能改变大鼠脑组织中某些基因的表达,进一步造成机体某些生理功能如学习记忆能力的变化。     

V-ras基因点突变与转化细胞恶性表型的研究

为进一步确定ras基因突变与肿瘤恶性表型的关系,我们构建了一系列的v-ras突变体并将其导入NIH 3T3细胞,观察这些细胞的恶性表型,如致瘤性,转移能力及细胞膜组织相容性抗原(MHC-I)的表达水平。实验证明不是全部具有形态转化的细胞都能在正常的Balb/c小鼠致瘤和形成远端转移。ras基因不仅能影响细胞的形态、致瘤性、转移能力,而且还通过调节MHC-I的表达水平来影响ras转化细胞的恶性表型。