GST融合蛋白包涵体纯化方法的探索

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

玉米螟谷胱甘肽转硫酶的纯化及性质研究

以亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)为材料,经Sephadex-G75、DEAE-Sepharose Fast Flow、还原型谷胱甘肽(GSH)为配基的亲和层析,分离纯化得到玉米螟谷胱甘肽转硫酶(GST)。以2,4-二硝基氯苯(CDNB)为底物测得其比活为1070U/mg蛋白,收率为22.9%,提纯1138倍。经SDS-PAGE和PAGE鉴定,得到的GST为一条带,亚基的分子量为25kD,经凝胶过滤测得其全酶分子量为50kD,说明该酶是由两个相同亚基组成的。IEF测得主带等电点为8.2。该酶最适温度为41℃,最适pH范围为6.3～6.9。经动力学测定该酶双底物反应机制为序列机制,对CDNB的K_m值为0.15mmol/L,对GSH的K_m值为0.35mmol/L,两种底物的k_cat均为783s^-1。Cl-对底物CDNB有竞争性抑制作用,对GSH是非竞争性抑制作用;3,5-二硝基苯甲酸(DNB)对CDNB有竞争性抑制作用,对GSH是反竞争性抑制作用。     

大片吸虫谷胱甘肽S-转移酶的提纯及生化分析

用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析法从中国广西水牛源大片吸虫（Ｆａｓｃｉｏｌａｇｉｇａｎｔｉｃａ）成虫体内提纯大片吸虫谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＦｇＧＳＴ）。提纯的ＦｇＧＳＴ在１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱上呈现二条清晰谱带,分子量分别为２６．５ｋＤ和２８ｋＤ。以ＣＤＮＢ为标准底物测得ＦｇＧＳＴ的活力为１７．０８μｍｏｌ／ｍｉｎｍｇ。用谷胱甘肽亲和层析柱纯化的ＦｇＧＳＴ,不仅纯度好,而且获得率高,所得ＦｇＧＳＴ至少占上柱上清液总蛋白含量的３．１％。     

翡翠贻贝(Perna viridis)谷胱甘肽硫转移酶同工酶的分离纯化及部分性质研究

以翡翠贻贝（Perna viridis）消化腺为材料,经GST rap^TMFF柱亲和层析,分离纯化得到总谷胱甘肽硫转移酶。而后经DEAE离子交换层析得到三个洗脱峰M₁、M₂、M₃,分别占总蛋白含量的77%,16%,2.9%,对其进行SDS-PAGE分析,结果表明M₁可能是由分子量为25 kD的蛋白质亚基组成的同型二聚体,M₂、M₃可能为异型二聚体,M₂由25 kD和23kD两个亚基组成,M₃由27kD和23kD两个亚基组成。以1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）、3,4-二氯硝基苯（DCNB）、4-硝基氯化苄（NBC）、利尿酸（ETHA）4种底物对M₁、M₂、M₃进行动力学分析,发现M₁、M₂、M₃分别对ETHA、DCNB、NBC亲和力更好,Km分别为1.08mmol/L、1.51 mmol/L、0.89mmol/L,Vmax分别为54.9μmol/min/mg,40.3μmol/min/mg,19.4μmol/min/mg。     

TBBPA对美洲鳗鲡谷胱甘肽代谢相关指标的影响

在实验生态条件下,研究了TBBPA对美洲鳗鲡(Anguilla rostrata)幼鳗体内谷胱甘肽代谢相关指标的影响.在本实验暴露剂量和时间范围内,GST活性高浓度组被显著诱导;GPx活性高浓度组首先在暴露第三天被显著诱导,其后暴露第七天降低至对照组水平,中浓度组则在暴露第七天被显著诱导;GR活性仅低浓度组表现为显著抑制作用;GSH含量仅中浓度组显著增加.这些相关指标的变化间接反映了生物体受到不同程度的氧化胁迫时表现出的应激效应,有可能作为水环境中TBBPA污染的生物监测指标.对照组中除GPx活性外,其余三个指标均随时间的变化显著升高或降低.表明这些指标易受环境非污染因素扰动的影响,因此作为生物标记时应充分考虑到各种可能的影响因素.     

酶活性及酶反应动力学分析

运用PCR扩增获得了属于尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)家族UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5的cDNA序列, 构建了三种基因的GST融合表达载体, 使用大肠杆菌对三种基因进行原核表达, 从裂解液上清中获得具有活性的目的蛋白.分别以ABA、对氨基苯甲酸作为反应底物, 通过高效液相色谱法, 测定三种蛋白的酶活力.结果发现除了UGT75B1对对氨基苯甲酸表现出很高的活性以外, 另外两种蛋白仅表现出了低水平的活性.三种蛋白对ABA都表现出了活性, UGT71B6具有最高的酶活力.对UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5三种蛋白对ABA的作用进行了体外酶反应动力学分析, 测定出它们的Km值分别为: 0.73、0.43和0.45mM.以上结果说明UGT75B1对对氨基苯甲酸的活性明显高于ABA, 对氨基苯甲酸是其专一底物.UGT71B6和UGT71C5对ABA都有较高的活性, 两者Km值差距不大.     

血吸虫抗原肽对某些肿瘤细胞的抑制作用

引言防治肿瘤是当今人类面临的最为迫切的医学难题之一,世界各国有为数众多的医药学家致力于该领域的研究,从已知的或新发现的各种化合物中筛选出具有抗肿瘤活性的物质仍是一种有效的方法。随着多肽化学的发展,具有各种生理活性的多肽分子不断被发现,而多肽分子作为天...     

基于灰色系统理论(GST)的贵州省旅游业发展分析与预测研究

基于灰色系统理论的灰关联分析(GRA)与GM(1,1)预测模型对贵州省旅游业发展进行了分析与预测研究。研究结果表明:与贵州旅游业发展相关联的4个内部影响因素由大到小分别为:旅游资源条件、旅游服务设施、旅游基础设施以及旅游接待设施;灰色预测GM(1,1)模型预测则显示贵州省旅游业将保持快速增长。最后针对研究结果提出了相关建议。     

渗透胁迫对小麦愈伤组织GST活性的影响

比较了渗透胁迫下抗旱性不同的小麦愈伤组织GST活性的变化。结果表明 ,水分胁迫初期2种愈伤组织GST活性均明显高于对照 ,重度胁迫的高于轻度胁迫 ;但在轻度胁迫下的后期小偃22细胞GST活性明显高于对照或与对照无明显差别 ,而郑引1号GST活性明显低于对照 ;说明GST可能与细胞对渗透胁迫的适应有关     

植物的谷胱甘肽转移酶家族

植物的谷胱甘肽转移酶(Glutathione transferases,GSTs;EC 2.5.1.18)是一个大家族;根据蛋白同源性和基因组织结构,植物GST分为φ、ζ、τ、θ、λ五类;GST主要在胞液中表达,是由约26kDa亚基组成的同源二聚体或异源二聚体,形成疏水的50kDa的蛋白;在不同组织和不同的环境条件下,基因表达差异很大.GST在植物的初级代谢和二级代谢、胁迫耐受、细胞信号等方面行使功能.     

AgNO3和低温处理对小麦细胞GST及GR酶活性的影响

研究了AgNO3和低温处理对小麦悬浮细胞谷胱甘肽转移酶(GST)及谷胱甘肽还原酶(GR)酶活性的影响.结果表明,AgNO3和低温处理对小麦细胞再生的影响因处理时间的不同而有差异,在处理的4 d内低温处理使再生率明显增加,AgNO3处理2 d使细胞再生率显著增高,但处理4 d则对细胞再生无明显影响.低温处理使细胞蛋白质含量明显升高,AgNO3处理对小麦细胞蛋白质含量无明显影响.小麦细胞GST活性随处理时间的延长而迅速降低,AgNO3处理对GST活性无明显影响,但低温处理明显延缓GST活性降低.AgNO3和低温处理都使小麦细胞GR酶活性明显降低.AgNO3处理2 d和低温处理对细胞谷胱甘肽(GSH)含量无明显影响,但在处理的第4 d AgNO3使细胞GSH含量明显降低.     

谷胱甘肽对老化小麦种子影响的研究

用不同浓度的GSH处理自然老化的小麦种子，研究了GSH对丙二醛（MDA），电解质渗漏和过氧化氢酶（CAT），过氧化物酶（POD）的影响，结果表明，100-500mg/L的GSH能减少膜脂过氧化产物MDA的含量，同时降低电解质渗透量，GSH对POD活性影响较小，而对CAT活性的影响较大，100-500mg/L的GSH，使CAT活性大幅增高，300mg/LGSH处理是减轻老化小麦种子膜脂过氧化的最佳浓度。     

小麦和青稞幼穗脱分化期间过氧化物酶和酯酶同工酶组成的变化

离体培养前的小麦和青稞的幼穗均含有极少量的过氧化物酶和酯酶同工酶。离体培养8h后,外植体中部分同工酶被一些新合成的同工酶替代,同工酶的数量显著增加。随着外植体的发育,新的同工酶分子不断出现。在愈伤组织形成的后期,部分同工酶逐渐消失,同工酶的数量也明显下降,过氧化物酶和酯酶同工酶的变化在小麦和青稞之间无显著的差别,在小麦或青稞中,过氧化物酶同工酶的变化也同酶酶同工酶的变化基本相同。文章讨论了这两种酶的变化与脱分化过程的关系及其与其它非禾各类植物中的酶的差异。     

呋喃丹水解酶的分离纯化及性质

从长期受农药污染的土壤中分离得到一株能高效降解氨基甲酸酯类农药的假单胞菌AEBL3，它在呋喃丹的诱导下能产生较高活性的呋喃丹水解酶。通过硫酸鱼精蛋白处理、(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE纤维素离子交换层析和苯基交联琼脂糖层析，从菌体中纯化得到凝胶电泳均一的呋喃丹水解酶，纯化倍数为30.33倍。用SDS-PAGE测得该酶的分子质量约为85ku，酶作用的最适温度为40℃，最适pH值为4.5和6.5，30℃下保温30min，酶活力基本不变，高于50℃酶活力则迅速下降；K^ 和Na^ 等对酶有激活作用，Hg^2 、Zn^2-、Cu^2 和Mn^2 等对酶有抑制作用。     

植物钙调素的分离纯化及其特性研究

本文以烟草愈伤组织和花椰菜这花序为材料，分离纯化钙调素。所得ＣａＭ的纯度用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定；生物活性用其对牛心肌环腺苷酸磷二酯酶（ＰＤＥ）的激活作用测定（ＣａＭ）的产量用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）测定。并比较了上Ｐｈｎｅｙｌ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ柱前对ＣａＭ溶液的不同处理。纯化的烟草愈伤组织和菜花ＣａＭ，具有牛脑ＣａＭ所特有的一些性质。它对牛心肌ＰＤＥ有明显激活作用，在含有Ｃａ＾２＋     

对硝基酚磷酸酶的原核表达、纯化及性质研究

克隆到脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus中的对硝基酚磷酸酶(p-nitrophenylphosphatase，pNPPase)基因，将其编码区eDNA连接到pQE30表达载体中，在E．coli M15中经IPTG诱导得到高效表达．用Ni-NTA Superflow层析柱对表达产物进行了分离纯化，初步测定了pNPPase的酶学性质．发现它的反应最适pH是10．0，最适反应温度是55℃，热稳定性Tm值为52℃，Mg^2 、Mn^2 和Co^2 对pNPPase的活性有一定的促进作用，而Zn^2 和Ni^2 对pNPPase没有影响．纯化后其比活为120U／mg．     

草鱼胰蛋白酶的分离纯化及性质研究

从草鱼肝胰脏中分离纯化出一种胰蛋白酶．纯化过程包括：硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sephamse离子交换,Sephacryl S-200凝胶过滤和Q-Sepharose离子交换层析．SDS-PAGE显示在分子量约为28．5ku处有单一电泳带,表明该酶已得到高度纯化．以Boc-Leu-Arg-Arg-MCA为底物测得该酶的最适温度为40℃．最适pH值为9．0．丝氨酸蛋白酶抑制剂（Pefabloc SC,PMSF,Benzamidine）对该酶的活力有明显抑制作用．底物特异性实验表明该酶特异性分解精氨酸和赖氨酸残基的C末端,进一步证明纯化蛋白为草鱼胰蛋白酶,其酶学性质与鲤鱼胰蛋白酶相似．     

谷胱甘肽及其类似物对小麦耐热性的影响

 利用冬小麦品种京都40和春小麦品种辽春17,以谷胱甘肽(GSH),寡肽(GCG)以及合成寡肽GCG所用的谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和γ-氨基丁酸(GABA)3种物质组合作处理,清水作对照,研究高温胁迫条件下不同处理对小麦幼苗抗高温胁迫生理特性的影响,明确寡肽GCG的生理活性。结果表明,在高温胁迫条件下,200μmol/L的GSH和GCG处理可使小麦保持较高的相对含水量,降低叶片质膜相对透性和丙二醛(MDA)的含量,有利于维持细胞膜的完整性。同时,在高温胁迫条件下,GCG处理显著提高了幼苗对二苯基苦基苯肼(DPPH)活性氧自由基的清除能力,且叶片中抗氧化酶活性也被诱导增强,有利于缓解高温对小麦幼苗的伤害。与其他2种处理相比,GCG的处理效果最为显著。综合来看,GCG具有类似GSH的抗氧化活性,可以增强小麦幼苗对高温胁迫的耐性,因此GCG作为一种人工合成的寡肽,有望作为农业生产调节剂来开发应用。