基于核酸适配体的荧光法检测中药中赭曲霉素A

赭曲霉素A(OTA)是污染中药材的重要真菌毒素,严重影响中药材质量和用药安全.在小檗碱溶液中加入OTA和其核酸适配体后,处于随意卷曲状态的核酸适配体会被OTA诱导折叠成为G-四链体构象,使小檗碱的微环境发生改变,从而增强其荧光信号.基于此,本文以OTA核酸适配体为识别原件,小檗碱为荧光探针发展了一种无标记的荧光体系检测OTA.对主要影响因素,包括K+,Mg2,小檗碱和核酸适配体浓度进行了优化.在最佳实验条件下,小檗碱荧光信号变化值与OTA浓度在5～200 nmol/L范围内成正比,检出限5 nmol/L.该方法仅使用无标记的核酸适配体完成了OTA的检测,避免了对核酸适配体的繁琐设计和标记.方法 有较高的特异性,并成功应用于中药桔梗中OTA的检测,回收率在86.3％～105.6％之间.     

鸟嘌呤四链体在生化分析中的应用进展

鸟嘌呤四链体(G-四链体)是一种特殊的核酸二级结构,它可与高铁血红素结合,形成具有过氧化物酶活性的核酶;也可增强特殊结构染料的荧光强度。G-四链体作为功能核酸中的一种,具有性质稳定、特异性好、功能多样等特点,被广泛应用于各种生化分析中。本文对近年来G-四链体在生化分析中的研究和应用进展进行了评述,对其应用前景进行了展望。     

一种不对称菁染料及其与不同结构DNA的相互作用

为考察小分子配基与不同核酸结构的结合机理,发展新的核酸探针分子,合成了一种新型一次甲基不对称菁染料(MTP).吸收光谱、荧光光谱及圆二色光谱研究结果表明,MTP可与平行和混合平行G-四链体DNA(如c-myc和22AGK+)较强地结合,并引起130~180倍的荧光增强;其与单/双链DNA作用较弱,导致40~60倍荧光增强;而与反平行G-四链体DNA(如TBA和22AGNa+)的作用最弱,只引起15~25倍荧光增强;以上结果表明MTP可作为荧光探针分子用于区别不同结构的核酸分子.结合机理研究表明,平行和混合平行G-四链体DNA优先通过沟槽结合模式结合1分子MTP,再通过末端堆积模式结合另1分子MTP.     

核酸适配体识别-荧光法检测赭曲霉素A

建立了核酸适配体识别-荧光探针技术检测赭曲霉素A(OTA)的新方法.基于微孔板上固定的核酸适配子与目标物质OTA结合时构象发生变化,导致预先与其互补杂交的FAM标记短链DNA解离,引起荧光信号发生变化,据此可实现对OTA的定量检测.当微孔板包被亲和素浓度为25 mg/L、适配子浓度为50 nmol/L,FAM标记互补短...     

电喷雾质谱法研究防己诺林碱与G-四链体的相互作用

采用电喷雾质谱法研究了防己诺林碱与双链核酸及G-四链体的相互作用. 结果表明, 防己诺林碱可选择性地与G-四链体结合. 利用串联质谱技术对防己诺林碱与核酸的结合模式进行了研究, 结果表明, 防己诺林碱可能通过末端堆积作用与G-四链体结合, 而通过插入作用与双链核酸结合. 结合模式的差异导致防己诺林碱选择性地与G-四链体结合.     

基于核酸碱基猝灭荧光团的核酸适配体传感器检测赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素A(OTA)是农产品中常见的霉菌毒素,对人和动物具有较强的毒性,以及致畸、致癌、致突变作用,因此,建立简单、快速、低成本、高灵敏的OTA检测方法是即时农产品质量监测和保障消费者安全的有效手段。本研究以鸟嘌呤碱基为猝灭剂,以单标记荧光素(FAM)的寡聚核酸为探针,基于核酸适配体构建了生物传感器,用于检测葡萄酒中的OTA。鸟嘌呤是具有多个给电子基团的稠杂环化合物,电子密度较大,在核酸碱基中氧化电位最低,最容易被氧化,作为电子供体可通过光诱导电子转移过程猝灭荧光基团。OTA不存在时,标记有FAM的寡聚核酸探针与OTA核酸适配体杂交,FAM靠近鸟嘌呤荧光被猝灭;样品中存在OTA时,其与核酸适配体特异性结合,形成四链体结构,抑制寡聚核酸探针与适配体结合,FAM的荧光得以恢复,通过FAM荧光强度的恢复率实现对OTA的检测。本方法检测OTA的线性范围为0.67～7.80 nmol/L,检出限为0.67 nmol/L (0.27μg/kg,S/N=3)。实际红酒样品中OTA的加标回收率为92.4%～100.9%。与纳米金、单壁碳纳米管、氧化石墨烯等纳米材料为猝灭剂的方法相比,本方法具有检测成...     

Loop长度对G-四链体DNA识别和结合肿瘤细胞的能力的影响

G-四链体是由富含鸟嘌呤(G)的核酸通过π-π堆积形成的核酸二级结构.前期研究发现,G-四链体DNA对肿瘤细胞具有普遍识别和结合能力,且具有如抗肿瘤增殖等生物学活性,但G-四链体DNA的结构对其识别和结合肿瘤细胞的能力的影响还未见报道.本文采用圆二色光谱和凝胶电泳对不同连接环(loop)长度G-四链体DNA的结构和稳定...     

连接环、末端碱基及一价阳离子对G-四链体结构的影响

研究了G-四链体中的连接环(Loop)、末端碱基和一价阳离子对其结构的影响,发现在K+溶液中Loop短的序列易形成平行结构,无末端碱基时容易形成多聚体,而反平行或混合平行/反平行的G-四链体则难以形成多聚体;一价阳离子K+,NH+4和Na+促进形成平行结构及多聚体的能力依次减弱.在平行G-四链体的3’或5’端增加非G碱基,或改变阳离子使其形成非平行结构,均可抑制多聚体的形成.Loop长度影响G-四链体的热稳定性,Loop短的序列可形成很稳定的分子内结构;无末端碱基的G-四链体多聚体的稳定性低于单个G-四链体,且多聚体随着温度升高而变小.结果表明,在K+溶液中,无末端碱基的平行G-四链体序列首先形成分子内结构,然后通过π-π堆积形成多聚体;末端碱基及反平行或混合平行/反平行G-四链体中的Loop可阻碍末端堆积作用,抑制多聚体的形成.本研究为G-四链体的结构与功能研究提供了有用信息.     

光学适配体传感器检测赭曲霉毒素A的研究进展

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是真菌产生的次级代谢产物,性质稳定,不易去除,人体摄入后将产生严重的健康危害。数十年来,核酸适配体不断发展,成为生物传感器的重要识别元件之一,适体传感器被广泛用于生物、医药、疾病等分析检测。本文总结了用于检测OTA的经典方法和基于核酸适配体的生物传感器方法,并主要从光学适配体传感器方面阐述了近年用于检测赭曲霉毒素A的适配体传感器,并对其进行了总结和展望。     

铅离子诱导PS2.M构象改变特性及其氡非标记比色传感检测新方法

以氡辐射衰变最终形成稳定的子体铅作为目标检测物,建立了检测氡累积浓度的核酸适配体生物分析新方法。K~+诱导富G单链核苷酸PS2.M形成反平行G-四链体四链体,辅因子血红素与G-四联链体结合,形成具有过氧化物酶活性的稳定复合物,催化TMB-H_2O_2体系发生显色反应。同时加入Pb~(2+)时,Pb~(2+)诱导PS2.M形成结构更加稳定的"缺口"型反平行G-四链体,K~+和血红素游离在溶液之中,体系吸光度响应值急剧降低。基于此构建了一种基于Pb~(2+)诱导PS2.M构象改变的过氧化物酶活性"Turn-off"型比色传感器。在5.0×10~(-9)~1.8×10~(-7)mol/L范围内,吸光度降低值ΔA与Pb~(2+)浓度呈线性关系,线性回归方程为ΔA=0.36+0.13C,R=0.9987。本方法对Pb~(2+)的检出限为3.76 nmol/L(S/N=3),氡的检出限为1.96×10~3Bq·h/m~3(S/N=3)。本方法灵敏、准确,样品溶液可直接检测,操作简单,避免了现场进行氡辐射剂量测量的放射性危害,为环境中氡的检测提供了新方法。     

基于核酸适配体修饰复合纳米纤维的分散固相萃取技术在赭曲霉毒素A检测中的应用

采用冷冻干燥法制备壳聚糖-海藻酸钠复合纳米纤维,此纤维呈均匀丝状结构,宽度约0.4μm。通过化学键合方式将赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)核酸适配体固载于纳米纤维表面,制备得到核酸适配体修饰的壳聚糖-海藻酸钠复合纳米纤维材料,适配体键合量达到2.3μg/mg,可作为分散固相萃取吸附剂。此吸附剂对OTA表现出良好的萃取能力及高选择性,萃取容量约为3.1 ng/mg,萃取量为结构类似物赭曲霉毒素B及5种参照物分子的2.44～12.8倍,相比随机序列修饰的复合纳米纤维以及复合纳米纤维,OTA的萃取量分别提高了4.88和13.0倍。在最佳萃取实验条件下,建立了基于核酸适配体修饰复合纳米纤维分散固相萃取-高效液相色谱测定OTA的分析方法,线性范围为0.05～3.0μg/L,检出限(LOD,S/N=3)为13 ng/L,加标回收率为86.7%～101.0%。本方法选择性好、灵敏度高,可用于花生、玉米和小麦等样品中痕量OTA的检测。     

荧光核酸适配体功能化氧化石墨烯生物传感器用于快速检测氯霉素

开发了一种无标记和快速的检测方法基于氧化石墨烯（GO）和荧光功能性G-四聚体探针（FGP），可用于定量检测氯霉素（CAP）.FGP由氯霉素核酸适配体和富含G碱基的核酸序列组成.核酸适配体用于结合CAP，并且由富含G碱基的核酸序列在K⁺，Na⁺离子的作用下形成的G-四聚体，然后与硫磺素T（ThT）结合后用作信号分子.在没有CAP的情况下，FGP通过π-π堆积相互作用被吸附到GO的表面上，阻碍了G-四聚体的形成导致溶液中的荧光强度低.在加入CAP时，FGP的核酸适配体部分可识别并结合CAP以形成复合物，导致其从GO解吸.因此，游离的富含G的碱基序列可以形成G-四聚体结构并与ThT结合，导致溶液的荧光强度增加.我们观察到荧光强度增加与CAP浓度在2~20 nmol/L范围内呈线性关系，检测限为1.45 nmol/L.此外，该检测系统用于检测加标牛奶中的CAP，回收率在93.2%~103.3%之间.这些结果表明，开发的方法可用于有效检测实际样品中的CAP.     

金标记羟胺放大化学发光检测赭曲霉毒素A

以羧基磁性微球为分离载体,连接氨基捕获探针和适配体,加入生物素化报告序列和赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)竞争结合适体,继续加入链霉亲和素纳米金和羟胺/Au~(3+)以显著提高化学发光检测OTA的灵敏度,从而建立了一种纳米金标记羟胺放大化学发光检测OTA的高灵敏度方法。优化了羧基磁性微球、氨基捕获探针、适配体、生物素化报告序列、链霉亲和素纳米金的用量。优化条件下,在OTA质量浓度0.01~50 ng/m L范围内,化学发光信号值与OTA浓度的对数呈较好的线性关系(r~2=0.992 5),检出限为1.58×10~(-3)ng/mL。对啤酒样品进行OTA加标回收实验,回收率为97.4%~105.4%,相对标准偏差为4.0%~5.5%。     

G-四链体-氯化血红素DNA酶在传感器设计中的应用

G-四链体-氯化血红素(hemin)DNA酶是一种由特定的核酸G-四链体与hemin结合后形成的具有过氧化物酶活性的人工模拟酶。作为一类重要的DNA酶,G-四链体-hemin DNA酶近年来在分析化学领域受到了越来越多的关注。目前这类DNA酶已被用在了多种传感器,包括金属离子传感器、适配体传感器、酶传感器、DNA传感器及药物传感器的设计当中。本文对G-四链体-hemin DNA酶在传感器设计中的应用进行了系统的介绍和评述,并对其未来的发展进行了初步的展望。     

基于小分子的核酸结构探针最新研究进展

本文主要综述了基于小分子的核酸结构探针的最新研究进展.所探索的核酸结构主要有四链核酸（包括G-四链体以及i-motif）结构、三链核酸结构、左手螺旋DNA结构以及不规则核酸结构（包括突起结构以及环状结构）等;所探索的小分子包括过渡金属配合物、大环共轭化合物、环肽以及寡糖抗生素等.     

与草甘膦特异结合的核酸适配体筛选及应用

通过体外指数富集配体系统进化(SELEX)技术,筛选靶向草甘膦核酸适配体A08。使用酶联寡核苷酸测定法(ELONA)和斑点印迹确认草甘膦核酸适配体A08与草甘膦的特异性,未观察到非特异性。基于ELONA平台,草甘膦检测限为4 ng/μL。圆二色谱(CD)实验表明,草甘膦核酸适配体A08形成茎环和分子内G-四链体,可以稳定存在于结合的磷酸盐缓冲溶液中。此外,亲和力实验显示草甘膦与核酸适配体之间具有强的结合力,解离常数(K_d)为38.38±9.094 nmol/L。基于草甘膦核酸适配体A08的ELONA法测定的准确性在真正的草甘膦样品中得到证实。获得的草甘膦核酸适配体A08为制备检测草甘膦试剂盒奠定了坚实的基础。     

基于G-四链体结构多态性的核酸纳米技术

G-四链体是由富G核酸形成的独特四链螺旋结构,区别于遵循A-T、G-C碱基互补配对原则形成的传统Watson-Crick双链结构.基于G-四链体的特异分子识别特性,能够引导纳米粒子的有序组装、赋予纳米器件以刺激一响应功能,使得核酸纳米技术领域的内容更丰富多样.本文介绍了G-四链体的结构多态性,从纳米材料组装和纳米器件设...     

核酸G-四链体的识别、复合物结构与细胞内探测的研究进展

富含鸟嘌呤的DNA或RNA序列可以折叠成非典型G-四链体二级结构. G-四链体结构丰富多样,在生物体内动态存在,参与了转录、复制、基因组稳定性和表观遗传调控等关键的基因组功能,与癌症生物学密切相关. G-四链体的结构与功能机制研究促进了以G-四链体为靶点的肿瘤治疗干预.本文综合评述了核酸G-四链体的特异性识别、细胞内探测及生物学功能的调控,总结了识别靶向G-四链体的小分子及复合物结构的研究进展,讨论了以G-四链体为靶点的靶向干预及疾病治疗的可能性,最后展望了G-四链体未来研究所面临的挑战与机遇.     

基于脱氧核酶的无标记端粒酶检测新方法

设计了一种发卡型核酸探针,结合脱氧核酶(DNAzyme)与支点介导链置换技术建立了一种检测端粒酶的新方法.该发卡型探针通过阻碍G-四链体的形成来抑制DNAzyme的过氧化物酶活性.当体系中的端粒酶引物TS被催化延伸后,可以通过链置换反应破坏该发卡结构,从而释放出自由的DNAzyme以催化过氧化氢氧化ABTS2-,产生可被检测的吸收信号变化.实验结果表明,应用该方法可以检测低至500个Hela细胞等当量的端粒酶,且该方法操作简单、不需要荧光标记和复杂的表面修饰,有望在肿瘤细胞端粒酶活性分析中获得广泛应用.     

基于磁珠分离的酶联适配体检测痕量蛋白质的新型比色分析方法

以核酸适配体作为高效专一的识别/传感元件, 构建了一种新型的磁性分离和特异性捕获的检测方法. 两个适配体通过简单的生物素化修饰, 利用其与凝血酶不同位点的高亲和力形成夹心结构, 其中连接适配体的磁珠可捕获蛋白质, 加入另一个适配体及链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶后, 通过比色法实现靶蛋白检测. 该法操作简单, 分析时间短, 对凝血酶的线性响应范围为 10~80 nmol/L, 检出限为 10 nmol/L.